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1、HCV核心蛋白在酵母双杂交系统中的表达及自激活作用检测作者：刘敏，张伟,陈天艳,蔺淑梅,刘锦锋,叶峰，赵英仁，张树林【关键词】蛋白 RoleofHCVcoreprotEininyeasttinreportergeneexpressionandactivation 【Abstract】AIM:ToconstructthebaitvectorofHCVcoreprotEIninyeasttandthentostudyitseffectonthegroentsencodingHCVcoreregionplifiedbyPCRandsubsequentl
2、yclonedintopUC19.Afterverifiedbysequencing,they.TheserebinantplasmidsentsofHCVcoreprotein3canbeutilizedtofishHCVcoreregioninteractingprotein.HCVcoreproteindoesnothaveselfactivatingfunction. 【Key;reportergene 【摘要】目的：检测用含丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白的cDNA片段构建的酵母双杂交诱饵载体的表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有
3、无激活作用.方法：PCR扩增含HCV核心蛋白不同大小的cDNA片段，分别克隆入pUC19质粒，经测序正确后，再分别亚克隆入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中.将重组质粒导入酵母菌AH109，检测其表达产物在酵母细胞中对报告基因有无激活作用.结果：成功获得含HCV核心蛋白的cDNA片段，HCV核心蛋白对酵母菌AH109无毒性，且对报告基因无激活作用.结论：利用酵母双杂交Gal4系统3研究与HCV核心蛋白相互作用的蛋白,证实了HCV核心蛋白无自激活功能. 【关键词】HCV核心蛋白；酵母双杂交；报告基因 0引言 丙型肝炎病毒(hepatitisCvir
4、us,HCV)核心蛋白位于病毒多肽的氨基末端，被宿主的信号肽酶切割后产生.HCV核心蛋白除了作为核壳蛋白具有病毒颗粒组装功能外，还具有调节细胞凋亡、脂代谢、转录、免疫呈递等作用［1］,其氨基酸序列高度保守，临床和实验研究显示HCV核心蛋白具有广泛的反式激活作用［2-3］，与宿主蛋白相互作用，可能是病毒感染导致肝细胞损伤和肝细胞癌发生、发展的重要原因.酵母双杂交系统是一种分析真核细胞中蛋白蛋白、蛋白DNA、蛋白RNA相互作用的基因分析方法.蛋白质与蛋白质的相互作用是很多生命现象的基础［4］.酵母双杂交Gal4系统3是在系统1和系统2基础上的改进，具有转
5、化效率高，假阳性率低等优点.我们利用它来克隆与HCV核心蛋白相互作用蛋白的基因，以期为HCV核心蛋白功能的研究提供新依据. 1材料和方法 1.1材料 克隆有HCV全长cDNA的质粒pCDNA3.0HCV由第四军医大学微生物学教研室尹文博士惠赠；表达载体pGBKT7，AH109酵母菌种（美国Clontech公司）；质粒pUC19菌种（本研究室保存）；PCR试剂盒、DNA重组所用的各种限制性内切酶、T4DNA连接酶（Gibco公司）；DNA电泳胶回收试剂盒（上海华舜生物工程公司）；酵母培养试剂（美国Clontech公司）. 1.2方法 1.2.
6、1PCR扩增克隆编码核心蛋白的引物为①引物P1:5′GCCGAATTCATGAGCACGAATCCTAAACCT3′；②引物P2:5′GCGTCGACTTAGGCTGAAGCGGGCACAGT3′.PCR反应条件为：94℃30s,55℃60s,72℃60s,30个循环. 1.2.2PCR产物克隆及鉴定纯化的PCR产物用EcoRI和SalI双酶切，定向克隆入pUC19质粒，转化大肠杆菌DH5α，进行蓝白筛选.酶切鉴定出含插入片段的阳性克隆命名为pUC19核心蛋白，进行序列分析. 1.2.3构建及鉴定诱饵载体用EcoRI，SalI酶切pUC19核心蛋
7、白和表达载体pGBKT7,回收核心蛋白及pGBKT7载体片段，载体片段与插入片段连接后转化大肠杆菌DH5α.经限制性内切酶分析，含正确插入片段的克隆命名为pGBKT7核心蛋白. 1.2.4转化酵母感受态细胞在1.5mL微量离心管中，加入已构建好的诱饵载体0.1μg，鲱鱼精DNA0.1mg和0.1mL酵母感受态细胞.混匀后加入0.6mLPEG/LiAc溶液.在30℃以200r/min振荡培养30min,加入70mLDMSO后混匀,在42℃水浴15min,冰浴2min,5000r/min离心5s,去上清，以0.5mL1×TE重悬细胞后，铺于SD/Trp
8、平板.于30℃培养36h左右，直至带有诱饵载体的酵母克隆长出. 1.2.5蛋白表达的检测 1.2.5.1
