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《hsp70诱饵载体的构建及其在酵母双杂交系统中自激活作用的检测》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。
1、HSP70诱饵载体的构建及其在酵母双杂交系统中自激活作用的检测：李静，杨守京，刘彦仿，周鹏，韩骅【关键词】热休克蛋白70 【Abstract】AIM:Toconstructthebaitvector(pGBKT7Hsp70)ofMATHMAKERGAL4T3,andtestitforitsautonomousactivation.METHODS:Hsp70geneplifiedbyPCRfrompBBS212Hsp70plasmid,andtheEcoRIandBamHIsitesousactivation.CONCLUSION:ThepGBKT7Hsp70ors,;autonomous
2、activation 【摘要】目的：构建用于酵母双杂交系统的“诱饵”载体pGBKT7Hsp70，并检测其是否具有自激活作用.方法：用PCR的方法从质粒pBBS212Hsp70中扩增出Hsp70基因片段，引入酶切位点EcoRⅠ,BamHⅠ.测序正确后，将Hsp70基因克隆至载体pGBKT7中，并检测pGBKT7Hsp70在MATHMAKERGAL4T3中的自激活作用.结果：成功构建了“诱饵”载体pGBKT7Hsp70，并证明其在酵母双杂交系统中无自激活作用.结论：pGBKT7Hsp70可以用于酵母双杂交系统中，寻找与Hsp70相互作用的分子. 【关键词】热休克蛋白70；酵母双杂交系统；自
3、激活作用 0引言 热休克蛋白（heatshockproteins,HSPs）是广泛存在于生物体内的一类高度保守的蛋白质，它参与蛋白质的合成、折叠、装配及转运，是细胞生存所必需的，且也是肿瘤细胞生存所必需的.反义hsps转染，可导致肿瘤细胞生长停滞或死亡［1-3］.热休克蛋白70（HSP70）是目前研究得较为深入的一个家族，与肿瘤的发生发展及预后关系密切.为寻找与HSP70相互作用的蛋白，并查明他们的相互作用位点及其体内外结合特性，我们拟采用酵母双杂交系统进行研究，构建酵母双杂交系统的诱饵载体pGBKT7HSP70，并转化酵母菌AH109，观察其是否具有自激活作用. 1材料和方法 1
4、．1材料质粒pBBS212Hsp70,DH5a菌种均为本室保存.酵母菌AH109为遗传与发育教研室保存. DNA重组的各种限制性内切酶，pMD18Tvector，T4DNALigase及PCR反应系统的LATaqDNA聚合酶，dNTP,10×PCR缓冲液，MgCl2分别购自TaKaRa公司.酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7，酵母培养试剂购自Clontech公司. 1．2方法 1．2．1构建诱饵载体(pGBKT7Hsp70)以质粒pBBS212Hsp70为模板，用PCR的方法扩增出目的基因Hsp70. 引物设计如下：3′GGGGATCCCTAATCT ACCTCCTCAATGGT；5
5、′GCGAATTCGCAGCTGCAATG GCCAAAGCCGCGGCGGCGAT;分别在两端引入酶切位点EcoRⅠ和BamHⅠ.反应总体积为50μL，其中包括：Primer5′0.1mmol，Primer3′0.1mmol,10xbuffer5μL,2.5mmol・L-1dNTP4μL,pBBS212Hsp7050ng,LATag0.5μL,H2O38μL.反应程序为：95℃预变性5min后,95℃1min,55℃1min,72℃1min，循环30次，最后72℃10min. 将获得的PCR产物电泳，胶回收后，克隆至载体pMD18Tvector中.酶切鉴定后，送往上海生
6、工测序.测序正确后，用EcoRⅠ,BamHⅠ酶切pMD18TvectorHsp70和载体pGBKT7.酶切产物电泳，胶回收目的片断和载体，通过连接，转化，构建诱饵载体(pGBKT7Hsp70). 1．2．2制备酵母感受态将酵母菌AH109菌种划线接种于YPDA平板上.30℃孵育2～3d后，沿划线长出白色克隆.挑取2～3个克隆，接种于5mLYPD液体培养基中，30℃，250r・min-1震荡培养16～18h，至A600>1.5.将该菌液按1∶10接种于10mLYPD中，使其A600=0.4～0.6，收菌5mL，室温离心5000r・min-1,5min,弃上
7、清，以5mL去离子水重悬，即为酵母感受态细胞. 1．2．3以pGBKT7Hsp70转化酵母感受态取0.1μg“诱饵”质粒pGBKT7Hsp70与0.1mg鲱鱼精DNA混匀后，加入100μL酵母感受态，轻混匀后，加入600μLPEG4000/LiAc混和液，剧烈震荡混匀.30℃震荡培养30min后，加入70μLDMSO，轻轻颠倒混匀，42℃热休克15min，冰浴2min,5000g,离心5s后去上清.沉淀用100μLTE
