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1、HSP70诱饵载体的构建及其在酵母双杂交系统中自激活作用的检测论文李静，杨守京，刘彦仿，周鹏，韩骅【关键词】热休克蛋白70【Abstract】AIM:Toconstructthebaitvector(pGBKT7Hsp70)ofMATHMAKERGAL4T3,andtestitforitsautonomousactivation.METHODS:Hsp70geneplifiedbyPCRfrompBBS212Hsp70plasmid,andtheEcoRIandBamHIsitesousactivation.CONCLUSION:ThepGBKT7Hsp70ors,;autonomo
2、usactivation【摘要】目的：构建用于酵母双杂交系统的“诱饵”载体pGBKT7Hsp70，并检测其是否具有自激活作用.方法：用PCR的方法从质粒pBBS212Hsp70中扩增出Hsp70基因片段，引入酶切位点EcoRⅠ,BamHⅠ.测序正确后，将Hsp70基因克隆至载体pGBKT7中.freel3中的自激活作用.结果：成功构建了“诱饵”载体pGBKT7Hsp70，并证明其在酵母双杂交系统中无自激活作用.结论：pGBKT7Hsp70可以用于酵母双杂交系统中，寻找与Hsp70相互作用的分子.【关键词】热休克蛋白70；酵母双杂交系统；自激活作用0引言热休克蛋白（heatshockp
3、roteins,HSPs）是广泛存在于生物体内的一类高度保守的蛋白质，它参与蛋白质的合成、折叠、装配及转运，是细胞生存所必需的，且也是肿瘤细胞生存所必需的.反义hsps转染，可导致肿瘤细胞生长停滞或死亡［1-3］.热休克蛋白70（HSP70）是目前研究得较为深入的一个家族，与肿瘤的发生发展及预后关系密切.为寻找与HSP70相互作用的蛋白，并查明他们的相互作用位点及其体内外结合特性，我们拟采用酵母双杂交系统进行研究，构建酵母双杂交系统的诱饵载体pGBKT7HSP70，并转化酵母菌AH109，观察其是否具有自激活作用.1材料和方法1．1材料质粒pBBS212Hsp70,DH5a菌种均为本
4、室保存.酵母菌AH109为遗传与发育教研室保存.DNA重组的各种限制性内切酶，pMD18Tvector，T4DNALigase及PCR反应系统的LATaqDNA聚合酶，dNTP,10×PCR缓冲液，MgCl2分别购自TaKaRa公司.酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7，酵母培养试剂购自Clontech公司.1．2方法1．2．1构建诱饵载体(pGBKT7Hsp70)以质粒pBBS212Hsp70为模板，用PCR的方法扩增出目的基因Hsp70.引物设计如下：3′GGGGATCCCTAATCTACCTCCTCAATGGT；5′GCGAATTCGCAGCTGCAATGGCCAAAGCCGCGGC
5、GGCGAT;分别在两端引入酶切位点EcoRⅠ和BamHⅠ.反应总体积为50μL，其中包括：Primer5′0.1mmol，Primer3′0.1mmol,10xbuffer5μL,2.5mmolL-1dNTP4μL,pBBS212Hsp7050ng,.freelin后,95℃1min,55℃1min,72℃1min，循环30次，最后72℃10min.将获得的PCR产物电泳，胶回收后，克隆至载体pMD18Tvector中.酶切鉴定后，送往上海生工测序.测序正确后，用EcoRⅠ,BamHⅠ酶切pMD18TvectorHsp70和载体pGBKT7.酶切产物电泳，胶回收目的片断和载体，通过
6、连接，转化，构建诱饵载体(pGBKT7Hsp70).1．2．2制备酵母感受态将酵母菌AH109菌种划线接种于YPDA平板上.30℃孵育2～3d后，沿划线长出白色克隆.挑取2～3个克隆，接种于5mLYPD液体培养基中，30℃，250rmin-1震荡培养16～18h，至A6001.5.将该菌液按1∶10接种于10mLYPD中，使其A600=0.4～0.6，收菌5mL，室温离心5000rmin-1,5min,弃上清，以5mL去离子水重悬，即为酵母感受态细胞.1．2．3以pGBKT7Hsp70转化酵母感受态取0.1μg“诱饵”质粒pGBKT7Hsp70与0.1mg鲱鱼精DNA混匀后，加入10
7、0μL酵母感受态，轻混匀后，加入600μLPEG4000/LiAc混和液，剧烈震荡混匀.30℃震荡培养30min后，加入70μLDMSO，轻轻颠倒混匀，42℃热休克15min，冰浴2min,5000g,离心5s后去上清.沉淀用100μLTE重悬，涂布于营养缺陷平板SD/Trp上，30℃孵育.1．2．4pGBKT7HSP70自激活检测待SD/Trp平板上长出克隆后，挑取单个克隆溶于10μL去离子水中，分别划线接种于SD/Trp,SD/Ura,SD/Leu,S
