hcv核心蛋白在酵母双杂交系统中的表达及自激活作用检测论文

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1、HCV核心蛋白在酵母双杂交系统中的表达及自激活作用检测论文刘敏，张伟,陈天艳,蔺淑梅,刘锦锋,叶峰，赵英仁，张树林【关键词】蛋白RoleofHCVcoreproteininyeasttinreportergeneexpressionandactivation【Abstract】AIM:ToconstructthebaitvectorofHCVcoreproteininyeasttandthentostudyitseffectonthegroentsencodingHCVcoreregionplifiedbyPCRandsubsequentlyclonedintopUC19.

2、Afterverifiedbysequencing,they.TheserebinantplasmidsentsofHCVcoreprotein3canbeutilizedtofishHCVcoreregioninteractingprotein.HCVcoreproteindoesnothaveselfactivatingfunction.【Key;reportergene【摘要】目的：检测用含丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白的cDNA片段构建的酵母双杂交诱饵载体的表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用.方法：PCR扩增含HCV核心蛋白不同大小的cDNA片段

3、，分别克隆入pUC19质粒，经测序正确后，再分别亚克隆入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中.将重组质粒导入酵母菌AH109，检测其表达产物在酵母细胞中对报告基因有无激活作用.结果：成功获得含HCV核心蛋白的cDNA片段.freelL微量离心管中，加入已构建好的诱饵载体0.1μg，鲱鱼精DNA0.1mg和0.1mL酵母感受态细胞.混匀后加入0.6mLPEG/LiAc溶液.在30℃以200r/min振荡培养30min,加入70mLDMSO后混匀,在42℃水浴15min,冰浴2min,5000r/min离心5s,去上清，以0.5mL1×TE重悬细胞后，铺于SD/Trp平板.于30℃

4、培养36h左右，直至带有诱饵载体的酵母克隆长出.1.2.5蛋白表达的检测1.2.5.1酵母全菌蛋白的抽提挑取几个已转化的酵母菌在5mLSD/Trp培养液振荡培养过夜,次日转接于50mLSD/Trp培养液,在30℃以230r/min振荡培养至A600nm=0.4～0.6.在4℃，1000r/min离心收菌.将菌体置于液氮中冻存.以60℃的裂解缓冲液200μL融解菌体,混匀后加入0.2g玻璃珠,70℃孵育10min,剧烈混旋1min,在4℃，5000r/min离心5min.上清转移至新的Eppendorf管备用.沉淀在100℃水浴5min，再剧烈混旋1min，在4℃，5000r

5、/min离心5min后，上清转移至上述的Eppendorf管内,100g/LSDSPAGE电泳分析.1.2.5.2r为19×103可见明显目的条带且无杂带（图4）.2.5HIS3报告基因表达的检测可见单纯AH109酵母菌只在SD/Ura平板上生长，而含有pGBKT7核心蛋白质粒的AH109酵母菌可以在SD/Ura和SD/Trp平板上生长，但所有克隆在SD/His和SD/Leu平板上均不生长.2.6LacZ报告基因表达的检测含有HCV核心蛋白的酵母细胞显色中可见LacZ报告基因没有被HCV核心蛋白激活(图5).当LacZ报告基因被激活时β半乳糖苷酶大量表达，活性增高，在Xag

6、al存在时，菌落显深蓝色，且扩散面积较大.3讨论酵母双杂交技术是目前应用较多的钓取与已知蛋白直接相互作用分子的方法［5］.我们在酵母双杂交Gal4系统3基础上成功构建了融合有HCV核心蛋白的重组表达质粒pGBKT7核心蛋白，再将含HCV核心蛋白的重组质粒转化入Ura缺陷生长的AH109酵母菌中.通过Trp，Leu及His缺陷的营养筛选表明，带Trp营养筛选标记的重组表达质粒pGBKT7核心蛋白已成功转化入带有Ura营养筛选标记的AH109酵母菌中.带有重组表达质粒的AH109酵母菌在His营养缺陷的SD培养基上不能生长，说明构建的HCV核心蛋白对HIS3基因无激活作用.同时

7、β半乳糖苷酶印膜法及平板法检测结果也表明构建的HCV核心蛋白对LacZ基因无激活作用.说明HBV核心蛋白对AH109无毒性，且对报告基因无自激活作用.这与体外构建质粒共转染实验已经证明的结果相似.这样，我们就能利用核心蛋白为诱饵，从人cDNA文库中去钓取与其相互作用的蛋白.HCV核心蛋白除了作为核壳蛋白具有病毒颗粒组装功能外，还具有多种调控细胞、病毒基因表达及细胞生长以及免疫调节等功能.临床和实验研究显示HCV感染与HCC发生发展过程密切相关，其中病毒核心蛋白起到重要的作用［6］.早期研究认为，HCV属于非整合性R