hcv核心蛋白与hcbp1在哺乳双杂交系统中的相互作用论文

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1、HCV核心蛋白与HCBP1在哺乳双杂交系统中的相互作用论文陈云茹刘敏陈天艳张树林陈瑞琳张曦石磊【摘要】目的：探讨HCVcore与HCBP1的相互作用.方法：PCR分别扩增含HCVcore及HCBP1的cDNA片段，克隆入pGEMT载体，经测序正确后再分别克隆入哺乳双杂交的表达质粒pM和pVP16中，并转染入COS7细胞，48h后检测细胞中报告基因CAT的表达水平.结果：CATELISA检测显示pMcore与pVP16HCBP1实验孔A405nm值为0.1288，高于其它阴性对照，但低于阳性对照组A值.结论：哺乳双杂交系统证实HCV核心蛋白

2、与新基因HCBP1有一定的相互作用，可进一步研究HCBP1的细胞功能.【关键词】HCV核心蛋白；哺乳双杂交；报告基因基金项目：国家自然科学基金（30471532）；陕西省科学技术研究发展计划项目（2004K15G1）【Abstract】AIM:ToanalyzetheinteractionbetammaliantentsencodingHCVcoreproteinandHCBP1plifiedbyPCRandsubsequentlyclonedintopGEMTvector,respectively.Afterverifiedbysequenci

3、ng,theyids,pMandpVP16.Then,pMcore,pVP16HCBP1andpG5CAT,areportervector,allentgroupmaliantsHCBP1canbindeextent.Basedonthis,ammaliantmalianMATCHMAKERTega公司），DNA重组所用的各种限制性内切酶、T4DNA连接酶（大连宝生物公司）；DNA凝胶回收试剂盒Lipofectamine2000（Invitrogen公司），测序由上海生工生物工程有限公司完成.COS7细胞（中国科学院细胞库）;PureYiel

4、dTMPlasmidMidiprepSystem（美国Promega公司）.1.2方法1.2.1PCR扩增克隆编码核心蛋白基因的上游引物P1：5′GAATTCATGAGCACGAATCCTAAACCTC3′；下游引物P2：5′GAATTCGGCTGAAGCGGGCACAGTC3′；以质粒pGBKT7HCVcore为模板，PCR反应条件为：94℃30s，50℃30s，72℃60s，共35个循环.克隆编码HCBP1蛋白基因的上游引物P1：5′GAATTCATGTGCTCACTGCCTGTGCCCCG3′；下游引物P2：5′GGATCCG

5、GAAGCTGGGCTCGGGGCAG3′；以肝cDNA文库为模板，PCR反应条件为：94℃60s，63℃60s，72℃60s，共30个循环.1.2.2PCR产物的克隆及鉴定回收的PCR产物与pGEMT载体相连，转化大肠杆菌DH5α，进行蓝白筛选.用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定及PCR鉴定后将含插入片段的阳性克隆分别命名为pGEMTcore及pGEMTHCBP1，进行序列分析.1.2.3表达载体的构建及鉴定用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切pGEMTcore和表达载体pM，pGEMTHCBP1和pVP16，回收coreprotein，pM，

6、HCBP1及pVP16，载体与插入片段连接后转化大肠杆菌DH5α，经限制性内切酶和PCR分析，含正确插入片段的克隆分别命名为pMcore和pVP16HCBP1，并用质粒提取试剂盒进行大规模的质粒提取和纯化.1.2.4转染COS7细胞于转染前1日将细胞用胰酶消化，计数并铺板，使转染当日细胞融合度为90%～95%.在铺板和转染期间避免使用抗生素.对每个转染样本进行如下操作：①在500μL无血清的培养基中稀释以下三种质粒共8.8μg，使pMcore质粒∶pVP16HCBP1∶CAT质粒比例为5∶5∶1;②在每孔中，用500μL无血清培养基稀释2

7、2μL阳离子脂质体试剂，室温孵育5～10min;③将稀释的DNA同稀释的脂质体试剂混合，室温保温20min;④用1mL无血清培养基在转染前清洗细胞;⑤将质粒DNA与脂质体试剂的混合物加入细胞，37℃50mL/LCO2保温6h;⑥6h后弃去复合物，加入新鲜的完全培养基至正常体积;⑦转染48h后，弃去细胞培养液，用5mL冰预冷的PBS洗细胞3遍，最后小心弃去PBS;⑧加1mLlysisbuffer，室温30min;⑨将细胞溶解后置于1.5EP中，4℃，离心10min;⑩吸取上清于-70℃迅速冷冻待检.实验同时设立阴性和阳性对照组.1.2.5报告基因表达

8、的检测按CATELISAKit说明操作.①标准孔：每孔加入0，1.0，0.5，0.25，0.125mg/LCAT酶标准稀释