鸭胚肾细胞用于鸭肝炎弱毒增殖的研究

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1、鸭胚肾细胞用于鸭肝炎弱毒增殖的研究卢顺，高其双，刘武，陈志华，周莉，占才耀，童伟文，陶弼菲，夏瑜，王莲芳，华娟（武汉市畜牧兽医科学研究所，武汉４３０２０８）摘要：为分析鸭胚肾细胞用于鸭肝炎病毒增殖的可能性，从鸭胚肾细胞的制备、体外培养、鸭肝炎弱毒在鸭胚肾细胞中的增殖等方面入手，初步分析了鸭胚肾细胞体外培养和用于鸭肝炎病毒增殖的可行性。结果表明，鸭胚肾细胞能够体外培养并形成良好的细胞单层，形态多为多边形或梭形；原代鸭胚肾细胞可以用于增殖鸭肝炎弱毒Ａ６６株，毒价（ＥＬＤ５０）达１０－４．２／０．２ｍＬ。说明鸭胚肾

2、细胞适合用于鸭肝炎病毒的增殖，有望用于鸭肝炎病毒疫苗的生产。..关键词：鸭胚肾细胞；体外培养；鸭肝炎弱毒中图分类号：Ｓ８５２．６５；Ｓ８５８．３２文献标识码：A：0439－８114（２０15）16－3983-03DOI:10.14088/j.ki.issn0439-8114.2015.16.038收稿日期：２０１４－１２－２９基金项目：武汉市农业科学技术研究院重大集成创新项目（ＣＸ２０１４０２）简介：卢顺（１９８２－），男，湖北鄂州人，兽医师，主要从事动物疾病防控与检测技术的研究，（）０２７－８１７７６３０９

3、（电子信箱）ｓｈｕｎ＿５５６０＠１２６．ｃｏｍ；通信，高其双（１９６３－），男，湖北监利人，正高职高级畜牧师，（电子信箱）ｇａｏｑｉｓｈｕａｎｇ５１８＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ。近年来，鸭病毒性肝炎在中国水禽养殖区广泛流行，给养鸭业带来了巨大的威胁。鸭病毒性肝炎由鸭肝炎病毒（ＤＨＶ）引起，主要危害３周龄以内的雏鸭，病死率可达１００％［１］。已报道的鸭肝炎病毒有３个血清型，即Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。中国已发现Ⅰ型和Ⅲ型鸭肝炎病毒，其中流行的主要是Ⅰ型［２］。目前尚无治疗鸭病毒性肝炎的特效药物，接种鸭肝炎疫苗是预防和控制该病的

4、最经济且行之有效的方法。在国内，鸭肝炎疫苗的生产还主要依靠传统的鸡胚培养技术［３］，使用细胞生产鸭肝炎病毒疫苗尚处在研究阶段，暂时还没有细胞源的鸭肝炎病毒疫苗上市销售。相比鸡胚培养技术，细胞培养病毒具有周期短、质量易控制和抗原纯度高等优点［４］，因此使用细胞生产鸭肝炎病毒疫苗是未来的发展方向。这也使得寻找适合培养鸭肝炎病毒的细胞成为研究的热点。目前，已报道用于培养鸭肝炎病毒的细胞系主要是鸡胚或鸭胚成纤维细胞系，关于其他细胞的研究较少。因此，寻找新的适合于鸭肝炎病毒增殖的细胞，能为鸭肝炎病毒及其疫苗的研究工作提

5、供新的细胞材料。本研究旨在探索鸭胚肾细胞用于鸭肝炎病毒增殖的可能性，为鸭肝炎病毒的研究和疫苗生产提供参考。１材料与方法１．１培养基及主要试剂ＤＭＥＭ高糖培养基（粉剂）和胎牛血清购自ＧＩＢＣＯ公司；双抗（青霉素、链霉素混合液，１００×）、胰蛋白酶购自Ｓｉｇｍａ公司；其他化学试剂均为分析纯。１．２毒株、鸭胚和鸡胚鸭肝炎病毒弱毒Ａ６６株（疫苗毒株）购自南京天邦生物科技有限公司；１２日龄鸭胚（江汉鸭）购自武汉市春江禽业有限责任公司；ＳＰＦ鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。１．３方法１．３．１试剂配制细胞培养

6、基配制：ＤＭＥＭ培养基按说明书配制，０．２２μｍ滤膜过滤除菌，４℃保存备用。临用前加入１５％胎牛血清和１％双抗配制成工作液。细胞消化液配制：取胰蛋白酶粉剂，用ＰＢＳ配制成０．２５％胰蛋白酶－０．０２％ＥＤＴＡ的细胞消化液，０．２２μｍ过滤除菌，分装于１０ｍＬ小瓶，－２０℃冻存备用。１．３．２鸭胚肾细胞的制备取１２日龄的鸭胚，在无菌环境中打开气室取出胚胎，立即放入盛有无菌ＰＢＳ（含２％的双抗）的平皿中，漂洗数次。将胚胎放入新的平皿中，剪开腹部，取出肾，置于另一无菌平皿中，ＰＢＳ漂洗２次。用眼科剪将肾组织剪成糜状

7、，加入２ｍＬ细胞消化液于３７℃消化１５ｍｉｎ。加入细胞培养基终止消化反应，离心收集细胞。细胞用培养基重悬，反复吹打制备成细胞悬液，分装于１００ｍＬ规格的细胞瓶中，于３７℃、５％ＣＯ２的培养箱中进行原代培养。１．３．３鸭胚肾细胞的传代培养３ｄ后原代细胞贴满细胞瓶底，弃去培养上清液，更换新的培养液。再次培养３ｄ后，用细胞消化液消化细胞。将消化好的细胞用培养基重悬，轻轻吹打使之分散。重悬的细胞在原细胞瓶中静置培养。细胞长满瓶底后，再次用消化液消化细胞，按１∶２的比例（１瓶内的细胞分装到２个细胞瓶内）进行传代培养。之

8、后每当细胞长满单层，即进行传代。１．３．４鸭肝炎弱毒在鸭胚肾细胞中的增殖待鸭胚肾细胞长成单层，弃去培养液，用ＰＢＳ清洗细胞１次，接种２ｍＬ鸭肝炎病毒液（２００ＥＬＤ５０／ｍＬ），置培养箱３７℃吸附１ｈ，弃去多余的病毒液，加入３７℃预温的细胞维持液（含１％胎牛血清的ＤＭＥＭ），置３７℃含５％ＣＯ２的培养箱中继续培养，逐日镜检，观察细胞变化。收获每次接毒的细胞培养物，反复冻融３次，离心收集上清液，弃去沉