扶正利湿活血复方对鸭胚肝细胞中鸭乙型肝炎病毒的抑

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1、扶正利湿活血复方对鸭胚肝细胞中鸭乙型肝炎病毒的抑【摘要】目的探讨扶正利湿活血中药复方水提物和醇提物对先天感染乙肝病毒（HBV）的鸭胚肝细胞乙型肝炎病毒（DHBV）的抑制作用。方法荧光定量PCR技术对鸭胚尿囊液DHBVDNA分析筛选先天感染DHBV的阳性鸭胚，对DHBV阳性的鸭胚肝细胞原代培养；细胞接种后第3天分组加入不同剂量扶正利湿活血复方水提物和醇提物，共6d，分别于药物干预前、药物干预第3天、第6天、停药第2天收集培养上清；辛酸钠法提取上清DHBVDNA，实时荧光定量PCR（FQ-PCR）检测分析血清DHBVDNA的含量。结果水提物各

2、剂量组组内不同时间点DHBVDNA载量相比无显著性差异（P﹥0.05），仅水提物低剂量组DHBVDNA载量显著低于相同时间点病毒对照组（P<0.05）；醇提物中、低剂量组在给药后和停药后培养上清DHBV均明显下降（组间、组内比较均为P<0.01），扶正利湿活血复方醇提物高剂量组在给药后第3天时DHBV明显下降（组间、组内比较均为P<0.01），第6天时组内比较无明显下降（P>0.05），而在停药后第3天时组内与组间比较又均有显著性差异（均为P<0.01）。结论扶正利湿活血复方醇提物对鸭胚肝细胞中的DHBV有直

3、接抑制作用，水提物在鸭体内可能不是通过直接抑制DHBV而起作用。【关键词】扶正利湿活血；鸭乙型肝炎病毒；肝细胞；荧光定量PCR　　Abstract:ObjectiveTostudytheinhibitoryeffectofChinesemedicinepoundprescriptionsFuzhengLishiHuoxueonduckhepatitisBvirus(DHBV)induckembryoliverCells.MethodsTheduckembryolivercellsedicinepoundFuzhengLishiHuoxue

4、,epointsafterthecellbeinginoculated.Resultsarker均购自Ferments公司；青霉素、链霉素为上海先锋药业公司产品；ix购自TOYOBO公司；PCR试剂胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司。ABI7300型荧光定量PCR仪，水平电泳设备。　　扶正利湿活血中药复方主要含旱连草、女贞子、山药、炙甘草、益母草、白花蛇舌草、丹参等，各成分购自广州采芝林医药连锁店，水提物制备用水煎煮2次，合并提取液后加热浓缩至1g/ml，储存于－20℃备用。醇提物用无乙醇浸泡，按处方比例称取药材

5、250g，加入无水乙醇800ml，密封常温浸泡24h后收集浸泡液；然后再如此法浸泡一次，合并浸泡液，减压浓缩至1g/ml，储存于－20℃备用。　　1.2先天感染DHBV阳性筛选　　将留取的尿囊液提取DNA，提取液组成：0.2mol/LNaOH，1%（in；再加入80μl异丙醇，混匀后4℃，13000r/min离心7min，弃上清，再加入40％异丙醇10000r/min，5min洗1次，然后用20μl去离子水溶解沉淀。用PCR法检测DHBV，PCR引物为：gatccactcctgggaaacaa-DS1；cagacagcgtggctaatt

6、ga-DS2。扩增产物为589bp；条件为：94℃预变性4min，然后94℃，30s，55℃，30s，72℃，1min。进行40个循环，然后再72℃延伸5min。　　1.3鸭胚肝细胞培养　　打开鸭胚后收集尿囊液留作筛选DHBV先天阳性鸭胚，筛选方法如前述。然后切取整个肝脏，用Hank's洗涤并剪碎，然后置于含有0.2％胶原酶II的培养基中于4℃消化过夜。培养基采用，HEPES15mM，胰岛素1μg/ml，青霉素100U/ml，链霉素33μg/ml，氢化可的松10－5M，二甲基亚砜1.5％，调pH至7.2。消化完后，每只鸭胚肝脏细胞用5ml

7、培养基洗涤两次，加入24ml培养基，吹打混匀后，加入24孔板中，每孔1ml。贴壁3h后换液，以后每天换液1次。　　1.4药物作用　　在细胞接种后第3天开始上药，扶正利湿活血复方水提物和醇提物，均为3个浓度，分别为10，1，0.1mg/ml。以拉米夫定作为阳性对照药，其浓度为1mmol/ml。上药6d，分别在药物干预前（D0）、第3天（D3）、第6天（D6）、停药第2天（P2）收集培养上清液，保存于－70℃待检。　　1.5DHBV荧光定量检测方法　　DHBVDNA提取用辛酸钠法，40μl培养上清液中加入120mmol/L辛酸钠20μl，99

8、℃加热10min，14000r/min离心10min，取2μl上清进行检测。FQ-PCR检测方法：以插入了DHBVS基因片段nt1251-1773的质粒作为标准品，10倍稀释做标准曲线。在标准