天花粉蛋白抑制hela细胞增殖的实验研究

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1、天花粉蛋白抑制HeLa细胞增殖的实验研究黄益玲，黄利鸣，惠燕，鲁华【关键词】天花粉蛋白；,,HeLa细胞；,,细胞凋亡　　摘要：目的研究天花粉蛋白(TCS)对人宫颈癌HeLa细胞生长的抑制作用,探讨TCS抗肿瘤的作用机制。方法采用MTT法检测TCS对Hela细胞的抑制作用，形态学观察、DNA电泳及流式细胞仪检测TCS对HeLa细胞的诱导凋亡作用。结果TCS对HeLa细胞的生长具有明显的抑制作用，显微镜下可见细胞圆缩，胞浆凝聚等凋亡细胞的形态学改变，DNA凝胶电泳呈梯级格局，流式检测出现凋亡峰，凋亡比例具有剂量和时间依赖性。结论天花粉蛋白通过诱导细

2、胞发生凋亡而抑制宫颈癌HeLa细胞的增殖。　　关键词：天花粉蛋白；HeLa细胞；细胞凋亡　　ExperimentalStudyofTrichosanthin'sEffectonHelaCellsProliferation　　Abstract：ObjectiveTostudytheinhibitoryeffectoftrichosanthin(Tcs)onHelacellsanditsanti-tumormechanism.MethodsTheantiproliferativeeffectofTCSonHelacellseasuredicrosco

3、pyorphologychanges,DNAagaroseelectrophoresisandFCManalysisinetheinducedapoptosis.ResultsTheproliferationofHeLacellseshrinkage,chromatincondensation;theoccurrenceofDNAladderandapoptosisrateofHelacellsedependent.ConclusionTrichosanthincaninhibittheproliferationofHelacellsbyitsi

4、nductionofapoptosis.　　Key）的块根中提取出来的一种单链核糖体失活蛋白(ribosome-inactivatingprotein,RIP)，具有多种生物学效应，主要包括免疫调节、抗肿瘤、抗病毒等作用〔1〕。目前，TCS的抗肿瘤研究主要集中在绒毛膜上皮癌、胃肠道肿瘤和白血病等方面〔2～3〕。本实验研究TCS对人宫颈癌HeLa细胞生长的抑制作用，并从诱导细胞凋亡的角度探讨其抗癌作用，为药物的进一步研究开发提供实验依据。　　1材料与方法　　1.1试剂MEM培养基和胎牛血清（FBS）购自美国GIBCOBRL公司，碘化丙啶（Propi

5、diumIodide，PI）及RNaseA(RNA酶)为Simga公司产品，噻唑蓝(MTT)购自Amresco公司。二甲基亚砜(DMSO)购自Fluka公司，TCS购自上海金山制药厂（纯品，规格为1.2mg/ml）。　　1.2细胞培养人宫颈癌HeLa细胞为本室传代保存,培养于5%CO2，37℃湿化孵箱中。培养基MEM含10%FBS，0.1U/L青霉素，0.1U/L链霉素，取对数生长期细胞待用。　　1.3细胞生长抑制实验采用噻唑蓝(MTT)还原法进行检测:将Hela细胞接种于96孔细胞培养板内(每孔的细胞数为2×104个)，细胞贴壁后对照组换新鲜培

6、养基，实验组换用含有不同浓度TCS的培养基，置CO2培养箱内分别培养24，48，72h，去上清，加入MTT溶液200μl/孔，置CO2培养箱内培养4h，去上清，每孔加入200μlDMSO，轻度振荡后，测定570nm处光吸收值。取8孔吸收值平均数，按公式细胞抑制率(%)=(1-实验组平均吸光度值/对照组平均吸光度值)×100%计算药物对细胞生长的抑制作用。　　1.4细胞凋亡的检测　　1.4.1细胞形态学观察将处于指数生长期的Hela细胞以不同浓度的TCS处理后，倒置显微镜下观察Hela细胞的形态改变。　　1.4.2DNA琼脂糖凝胶电泳　胰蛋白酶消化

7、收获实验组及对照细胞,1000r/min离心5min,PBS清洗细胞两遍,NP40溶液作用细胞沉淀,加入SDS(终浓度1%)及RNase(终浓度2μg/μl)，56℃处理2h，蛋白酶K(终浓度2μg/μl)37℃作用3～5h，加入1/10体积的3M醋酸钠及2倍体积的无水乙醇，轻轻振摇后置于-70℃冰箱中过夜,14000r/min离心15min，弃上清，用冰冷的70％乙醇漂洗，1.2%琼脂糖凝胶30V电泳3～5h，紫外观察拍照。　　1.4.3流式细胞仪检测分别离心收集对照组及实验组细胞，以含0.2%FBS的PBS清洗后加入75%冰冷的乙醇固定,在1

8、0000r/min条件下离心5min，去乙醇，PBS洗涤两次，弃上清；用0.5mlPBS重悬，加入等体积的细胞裂解缓冲液室温作用5min