(王娅琴)病原弧菌检测方法：免疫磁珠捕获-多重pcr技术的初步建立(终稿)

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1、病原弧菌检测方法：免疫磁珠捕获-多重PCR技术的初步建立摘要弧菌病是由弧菌属细菌引起的细菌性疾病，给海水养殖业带来了巨大的经济损失,同时对人类健康带来巨大的威胁。本研究旨在利用免疫磁珠捕获-多重PCR技术，建立一种快速、特异性强，同时检测多种病原弧菌的技术。通过亲和层析纯化的重组外膜蛋白K（OmpK）免疫新西兰大白兔制备抗血清，利用ELISA、Westernblotting、流式细胞仪检测OmpK抗血清与弧菌及外膜蛋白的结合，结果提示OmpK为副溶血弧菌、溶藻弧菌和河弧菌的交叉抗原。Sarkosyl（N-十二烷基肌氨酸钠）法提取弧菌外膜蛋白，以霍乱弧菌外膜蛋白免疫新西兰大白兔制

2、备抗血清，Westernblotting结果显示，霍乱弧菌外膜蛋白抗血清与多种弧菌外膜蛋白在25kDa、38kDa、40kDa、58kDa、70kDa等处有较强结合，推测弧菌间存在新的交叉抗原。通过混合引物和混合模板的PCR体系，验证了副溶血弧菌、霍乱弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌和拟态弧菌5种病原弧菌的mPCR引物具有稳定性及特异性。实验结果为免疫磁珠捕获-多重PCR技术的建立提供研究基础。关键词：病原弧菌、交叉抗原、免疫磁珠分离、mPCR22PrimarystudyofdetectionofpathogenicvibriosbyMagneticimmuunocapture-mul

3、tiplepolymerasechainreaction(MIC-mPCR)AbstractVibrioisreportedtobeauniversalmarinepathogenthathascausedvibriosiswhichbringhugeeconomicdamagetomariculture.Vibrioisalsoawell-knownhumanpathogen,causinggastroenteritisthroughconsumptionofraworundercookedseafood.Magneticimmuunocapture-multiplepoly

4、merasechainreaction(MIC-mPCR)wasdevelopedfordetectionofseveralkindsofvibriosatthesametime.TherecombinantoutermembraneproteinKwereusedtoimmunizeNewZealandrabbitstoobtainpolyclonalantibodies.ThecoalescentamongOmpKantibody,bacteriacellandoutermembraneproteinsweremeasuredbyELISA,Westernblottinga

5、ndFlowCytometry.TheresultsindicatethatOmpKisasortofcross-reactingantigenamongVibrioparahaemolyticus,V.flurialisandV.alginolyticus.WesternblotanalysisofvibriooutermembraneproteinwithserumofV.choleraeshowedthattherewereseveralcross-reactingbandsin25kDa,38kDa,40kDa,58kDaand70kDa.It’sindicatedth

6、atdifferentcross-reactingantigensexistamongvibrios.Themultipleprimersystemandmultipletemplatesystemweretestedon5pathogenicvibrios,indicatingthestabilityandspecificityofmPCRprimers.Keywords:pathogenicvibrio,cross-reactingantigen,Magneticimmuunocapture,multiplepolymerasechainreaction(MIC-mPCR)

7、.22目录摘要IAbstractII目录III1.前言11.1致病弧菌的危害11.2目前国内外弧菌检测方法研究进展11.2.1免疫学方法11.2.2分子生物学方法21.3免疫磁珠捕获-mPCR弧菌检测技术31.4免疫磁珠捕获系统31.4.1弧菌主要外膜蛋白及免疫原性41.4.2交叉抗原41.5多重PCR检测系统42.实验材料52.1实验菌株52.2实验动物52.3实验试剂52.4培养基62.5仪器63.实验方法63.1外膜蛋白的提取与纯化63.1.1弧菌总外膜蛋白的提取63.1.2重组Omp