(王娅琴)病原弧菌检测方法免疫磁珠捕获-多重PCR技术的

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1、病原弧菌检测方法：免疫磁珠捕获-多重PCR技术的初步建立摘要弧菌病是由弧菌属细菌引起的细菌性疾病，给海水养殖业带來了巨大的经济损失，同时对人类健康带来巨大的威胁。木研究旨在利用免疫磁珠捕获■多垂PCR技术，建立-•种快速、特异性强，同时检测多种病原弧菌的技术。通过亲和层析纯化的重组外膜蛋白K(OmpK)免疫新西兰大白兔制备抗血清，利用ELISAWesternblotting、流式细胞仪检测OmpK抗血清与弧菌及外膜蛋白的结合，结果提示OmpK为副溶血弧菌、溶藻弧菌和河弧菌的交叉抗原。Sarkosyl(N・十二烷基肌氨酸钠)法提取弧菌

2、外膜蛋白，以霍乱弧菌外膜蛋白免疫新西兰人白兔制备抗血清，Westernblotting结果显示，霍乱弧菌外膜蛋白抗血清与多种弧菌外膜蛋白在25kDa、38kDa、40kDa>58kDa>70kDa等处有较强结合，推测弧菌间存在新的交义抗原。通过混合引物和混合模板的PCR体系，验证了副溶血弧菌、霍乱弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌和拟态弧菌5种病原弧菌的mPCR引物具有稳定性及特异性。实验结果为免疫磁珠捕获■多重PCR技术的建立提供研究基础。关键词：病原弧菌、交叉抗原、免疫磁珠分离、mPCRPrimarystudyofdetectionofp

3、athogenicvibriosbyMagneticimmuunocapture-multiplepolymerasechainreaction(MIC-mPCR)AbstractVibrioisreportedtobeauniversalmarinepathogenthathascausedvibriosiswhichbringhugeeconomicdamagetomariculture.Vibrioisalsoawell-knownhumanpathogen,causinggastroenteritisthroughconsu

4、mptionofraworundercookedseafood.Magneticimmuunocapture-multiplepolymerasechainreaction(MIC-mPCR)wasdevelopedfordetectionofseveralkindsofvibriosatthesametime・TherecombinantoutermembraneproteinKwereusedtoimmunizeNewZealandrabbitstoobtainpolyclonalantibodies・Thecoalescent

5、amongOmpKantibody,bacteriacellandoutermembraneproteinsweremeasuredbyELISA,WesternblottingandFlowCytometry.TheresultsindicatethatOmpKisasortofcross-reactingantigenamongVibrioparahaemolyticus.VflurialisandV.alginolyticus.Westernblotanalysisofvibriooutermembraneproteinwit

6、hserumofV.choleraeshowedthattherewereseveralcross-reactingbandsin25kDa,38kDa,40kDa,58kDaand70kDa・ITsindicatedthatdifferentcross-reactingantigensexistamongvibrios.Themultipleprimersystemandmultipletemplatesystemweretestedon5pathogenicvibrios,indicatingthestabilityandspe

7、cificityofmPCRprimers.Keywords:pathogenicvibrio,cross-reactingantigen,Magneticimmuunocapture,multiplepolymerasechainreaction(MIC-mPCR).目录摘要IAbstractII目录HI1.前言11.1致病弧菌的危害11.2目前国内外弧菌检测方法研究进展11.2.1免疫学方法11.2.2分子生物学方法21.3免疫磁珠捕获-mPCR弧菌检测技术31.4免疫磁珠捕获系统31.4.1弧菌主要外膜蛋白及免疫原性41.4.

8、2交叉抗原41.5多重PCR检测系统42.实验材料52.1实验菌株52.2实验动物52.3实验试剂52.4培养基62.5仪器63.实验方法63.1外膜蛋白的提取与纯化63.1.1弧菌总外膜蛋白的提取63.1.2重组OmpK的提取与纯化