用重组人胰岛素原类似物免疫制备抗胰岛素单克隆抗体

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1、用重组人胰岛素原类似物免疫制备抗胰岛素单克隆抗体【摘要】目的制备抗胰岛素单克隆抗体（mAb）。方法用重组人胰岛素原类似物免疫BALB/c小鼠制备免疫脾细胞，运用淋巴细胞杂交瘤技术将其与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合。结果建立了7株分泌抗胰岛素mAb的杂交瘤细胞系，命名为A、B、C、D、E、F和G；7株mAb的Ig亚类分别为IgM、IgM、IgM、IgG2b、IgG1、IgG1和IgG1；在夹心ELISA试验中，7株mAb均能与人、牛和猪胰岛素发生特异性免疫反应；在免疫印迹试验中，7株mAb均能与重组人胰岛素原类似物结合呈现一条蛋白印迹带。结论7株mAb对人、牛和猪胰岛素均具有免疫反应性，可用

2、于人和动物胰岛素的测定和纯化。【关键词】单克隆抗体（mAb）；胰岛素；重组人胰岛素原类似物Developmentofmonoclonalantibodiesagainstinsulinbyimmunizationanproinsulinanalog【Abstract】ObjectiveTopreparemonoclonalantibody(mAb)againstinsulinMethodsSpleencellsfromBALB/cmiceimmunizedanproinsulinanalogyelomacellsbyusinghybridomatechniques.ResultsSeven

3、hybridomassecretingmAbagainstinsulinAbAbcouldspecificallyreacthuman,cattleorpiginsandAbanproinsulinanalogedbyimmunoblottingassay,onlyonestainedprotEinbandappearedonthetransferredfilm.ConclusionThesevenmAbareimmunologicalspecifictoinsulinderivedfromhuman,cattleorsonoclonalantibody(mAb);insulin;rebi

4、nanthumanproinsulinanalog胰岛素是具有重要生理功能的一种多肽类激素，在治疗糖尿病方面具有重要用途。胰岛素抗体是胰岛素测定和纯化所必需的免疫学试剂。为此进行了本研究。1材料与方法1.1菌种、质粒和细胞大肠杆菌JM109、小鼠骨髓瘤SP2/0细胞系、含有λ噬菌体PRPL串联启动子的人胰岛素原类似物（BKRA）基因表达质粒pBV-BKRA由本课题组构建和保存［1］。1.2免疫血清的制备收集大肠杆菌JM109培养物，离心沉淀菌体，用超声波破碎，加福氏佐剂乳化后，经皮下注射免疫兔，制备JM109免疫血清。1.3重组人胰岛素原类似物的制备用pBV-BKRA转化JM109［1〗。

5、取单个菌落，30℃培养14h，以20%接种在含卡那霉素（Kan）的新鲜LB培养液中，42℃振荡培养4h，高速离心沉淀菌体。参照1.9.2特异性1.9.2.1夹心ELISA用7株mAb作为捕捉抗体分别包被ELISA反应板，以人胰岛素（Sigma产品）、牛胰岛素（Sigma产品）、猪胰岛素（南京生化制药厂产品）作为被捕捉物分别与之反应，再加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗胰岛素单克隆抗体（Sigma产品）反应显色，检验7株mAb能否捕捉胰岛素。1.9.2.2免疫印迹试验采用免疫印迹法［5〗分析。重组菌诱导表达后，将菌体进行SDS-PAGE，电泳转移到硝酸纤维素膜上，用7株mAb分别与转移膜反

6、应后，再加碱性磷酸酶（AP）标记的山羊抗鼠IgG与转移膜反应，显色。实验同步设立JM109菌与pBV220转化菌对照。2结果2.1重组人胰岛素原类似物的制备用SDS-PAGE和凝胶扫描分析，包涵体中重组人胰岛素原类似物的含量达到80%（图1）。图1pBV-BKRA的诱导表达与mAb表达（略）2.2细胞融合与克隆化融合细胞的阳性率为2.4%（7/288）。从中选取7个阳性孔进行克隆化，经3次克隆后，所有细胞生长孔均呈阳性反应。2.3单克隆抗体的效价和亚类间接ELISA法测定7株mAb细胞培养上清液中的抗体效价为102，而诱生腹水中的抗体效价达到105～106。Ig亚类鉴定结果见表1。表17株

7、抗胰岛素mAb的效价和Ig亚类（略）2.4单克隆抗体的特异性在夹心ELISA试验中，7株mAb均能捕捉到人、牛和猪胰岛素；在免疫印迹试验中，7株mAb均能与重组人胰岛素原类似物（分子量12KD）结合呈现一条蛋白印迹带（图1-A～G）。表明用重组人胰岛素原类似物免疫制备的7株mAb对人、牛和猪胰岛素均具有特异的免疫反应性。3讨论本实验用重组人胰岛素原类似物免疫BALB/c鼠，成功地获得了7株抗胰岛素mAb，可与人、牛、猪胰