重组人工胰岛素

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1、姓名：胡霞学号：201014010140班级：10级生科1班重组人工胰岛素重组人工胰岛素胡霞一、概念1、概念：重组DNA技术生产的由51个氨基酸残基组成的蛋白质，宿主细胞为大肠杆菌。按干燥品计算，每1mg含重组人胰岛素不得少于27.5单位。重组人胰岛素中残余宿主DNA和宿主细胞蛋白质为与生产过程相关的、潜在的特异性杂质，必须在生产过程中严格控制，其限度应符合有关规定。2、形状该品为白色或类白色的结晶性粉末。该品在水、乙醇和乙醚中几乎不溶，在稀盐酸和稀氢氧化钠溶液中易溶。3、物化性分子量：5807.5702

2、2分子式：C257H383N65O77S6水溶性：2.0:2mg/mL储存条件：2-8°C二、工艺流程1重组人工胰岛素的生产原理通过基因工程酵母菌发酵生产hPI，经后加工形成hI。酵母系统下游后加工比细菌表达系统简单，但缺点是生产慢，生产周期长，且重组蛋白分泌量少(1～50mg／L)，产量低。因此，虽然rhI投放市场已久，但人们一直在努力寻求和探索更加有效的表达系统和高效的表达策略I2J，尤其是对E．CO一尻表达系统的研究更是越来越深入，用E．coli系统表达hPI的策略也越来越多。另一方面，在胰岛素的基

3、因工程生产中，下游处理非常复杂，复杂的下游处理极大地降低了胰岛素的最终收率。本研究围绕着提高重组目的蛋白表达量，简化下游处理过程等方面进行探索，建立了一套经过优化的高效完整的基因工程E．coli发酵表达(His)6一Arg—Arg一人胰岛素原[(His)6一Arg—Arg—humanproinsulin，PPh—PI]，后加工成hI的制备工艺。2重组人工胰岛素的生产工艺流程2.1菌种的制备2.1.1目的基因的提取既从人的DNA中提取胰岛素基因，可使用限制性内切酶将目的基因从原DNA中分离。主要有如下4种方

4、法：（1）鸟枪法：用一大堆限制性核酸内切酶对附近基因进行剪切，再提取所需要的。至于如何筛选，用DNA分子杂交，即DNA探针（2）人工合成法：根据转录蛋白或者mRNA推导出基因序列，然后人工合成，没有内含子。（3）从基因文库中提取：也就是事先已经提取完毕的拿来用（4）PCR扩增技术：用于大量生产该段基因片段，用于商业化运作。2.1.2提取质粒使用细胞工程,培养大肠杆菌，从大肠杆菌的细胞质中提取质粒质粒为环状。碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析

5、。2.1.3基因重组将取出目的基因与质粒，先利用同种限制性内切酶将质粒切开，再使用DNA连接酶将目的基因与质粒“缝合”，形成一个能表达出胰岛素的DNA质粒。2.1.4将质粒送回大肠杆菌再大肠杆菌的培养液中加入含有Ca+的物质，如CaCl2,这使细胞会吸收外源基因，此时将重组的质粒也放入培养液中，大肠杆菌便会将重组质粒吸收。将大肠杆菌用氯化钙处理，以增大大肠杆菌细胞壁的通透性，使含有目的基因的重组质粒能够进入受体细胞，此时的细胞处于感受态（理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态）。2.

6、2胰岛素的产生和精制（即菌种的发酵培养）重组人工胰岛素的工业生产制备和深加工技术在如今已经是炉火纯青。有近百年的发酵工程为基础，结合现在的基因工程技术的产物，在菌种制备后的发酵培养过程更是可靠和安全的。菌种扩培发酵培养流程见下图表：对从菌种库中取出的菌种进行活化及初步扩大培养种子罐培养在种子罐中对菌种进行进一步的扩大培养，至菌种到对数生长期时转入发酵罐培养发酵罐培养分两阶段进行控制，第一阶段主要通过控制溶氧和补加甘油使菌体达到富集的目的，第二阶段通过补加甲醇使菌体进行高密度表达目的产物，HPLC检测目的产

7、物含量发酵液固液分离目的产物存在于发酵液上清中，此步骤主要控制目的产物收率P1纯化通过两步柱层析，分别去除发酵上清液中的色素和杂蛋白利用紫外检测仪控制目的产物收率，主要试剂为乙醇与异丙醇P1沉淀、干燥调节PH值，使P1沉淀，再经离心干燥，得中间体I固体P2纯化控温进行转肽反应，主要试剂为DMSO与1,4-丁二醇再通过柱层析进行提纯，主要试剂为异丙醇P2沉淀、干燥调节PH值，使P2沉淀，再经离心干燥，得中间体II固体脱帽通过控制湿度与温度进行脱帽反应，得到终产物胰岛素主要试剂为丙酮，产品为半固体成品粗纯化经

8、过两步柱层析对胰岛素进行提纯，试剂为Tris-HCl和异丙醇通过超滤对提纯后的胰岛素进行浓缩，通过管道传递到下工序成品精纯化通过制备色谱对胰岛素粗品进行精制，主要试剂为色谱乙腈然后经两步结晶后通过管道过滤除菌到百级区过滤冻干对胰岛素成品进行一次结晶和水洗对水洗后的胰岛素进行过滤除菌后冻干，即得胰岛素成品制得的胰岛素经过深加工，可以得到片剂，注射剂和肺部吸入制剂等。3药物检测这种重组人工胰岛素的检测重点应该是①测定生物活性②效价