大肠杆菌生产制备重组人胰岛素工艺.doc

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1、.1.提取目的基因:既从人的DNA中提取胰岛素基因,可使用限制性内切酶将目的基因从原DNA中分离.2.提取质粒:使用细胞工程,培养大肠杆菌,从大肠杆菌的细胞质中提取质粒,质粒为环状DNA.3.基因重组:取出目的基因与质粒,先利用同种限制性内切酶将质粒切开,再使用DNA连接酶将目的基因与质粒"缝合",形成一个能表达出胰岛素的DNA质粒.4.将质粒送回大肠杆菌:再大肠杆菌的培养液中加入含有Ca+的物质,如CaCl2,这使细胞会吸收外源基因.此时将重组的质粒也放入培养液中,大肠杆菌便会将重组质粒吸收.5.胰

2、岛素的产生:再大肠杆菌内,质粒通过表达转录与翻译后,便产生出胰岛素蛋白质.通过大肠杆菌的大量繁衍,便可大量生产出胰岛素!〖学习要求〗知道DNA的粗提取与鉴定的原理;掌握并能分析DNA粗提取的技术方法和要求;学会DNA分子的鉴定方法【预习指导】在课前时间通过阅读教材、同学交流和讨论,完成下列问题,并初步巩固。一、基础知识【活动1】阅读教材P54“基础知识”,讨论并回答下列问题:1.(记忆)提取生物大分子的基本思路是利用它们的理化性质的不同进行分离。2.(记忆)DNA的溶解性特点:DNA在不同浓度NaCl

3、溶液中溶解度不同;DNA不溶于酒精而蛋白质溶于酒精。【思考1】据图5-1分析:DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度有何特点?在0.14mol/L时溶解度最小;..要使DNA溶解,需要使用什么浓度?较高浓度,可使DNA溶解;要使DNA析出,又需要使用什么浓度?0.14mol/L可使DNA析出。【思考2】利用DNA不溶于酒精的原理,可以达到将DNA和蛋白质进一步分离目的。3.(记忆)DNA的耐受性特点:蛋白酶能分解蛋白质而不能分解DNA;在60~80℃时蛋白质变性沉淀而DNA分子不变性。洗涤剂能与蛋白质结

4、合瓦解细胞膜而不破坏DNA分子。4.(记忆)DNA的鉴定原理当鉴定提取出的物质是否是DNA时,需要使用二苯胺(甲基绿)进行鉴定。在沸水浴条件下,该试剂与DNA反应,呈现(浅)蓝色。二、实验设计【活动2】阅读教材P55“实验设计”,讨论并回答下列问题:1.(记忆)实验材料的选取:选取材料时应本着DNA含量高、材料易得、便于提取的原则。【思考3】你认为教材提供的材料中哺乳动物的血液不适合提取DNA。2.(记忆)破碎细胞,获取含DNA的滤液:..鸡血:向鸡血细胞液中加入一定量蒸馏水并玻棒搅拌,用纱布过滤后,

5、收集滤液。洋葱:向研钵中加入一定量洗涤剂和食盐,搅拌研磨,用纱布过滤后,收集滤液。【思考4】在以上实验中,蒸馏水的作用是使血细胞大量吸水而胀裂,洗涤剂的作用是瓦解细胞膜,食盐的作用是溶解DNA物质。3.(学会)去除滤液中的杂质:方案一:30mL滤液→加NaCl使DNA溶解→过滤得滤液→加蒸馏水使DNA析出→过滤得过滤物→放到2mol/LNaCl溶液中溶解→DNA-NaCl溶解液方案二:30mL滤液→加嫩肉粉(木瓜蛋白酶)→静置10分钟→得DNA滤液方案三:30mL滤液→60~67℃处理→过滤得DNA滤

6、液【思考5】以上三个方案的原理分别是什么?方案一原理:DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同;方案二原理:蛋白酶分解蛋白质,不分解DNA;方案三原理:DNA耐高温而蛋白质不耐高温。..【思考6】方案一中:“加NaCl使DNA溶解→过滤得滤液”的目的是除去不溶(可溶、不溶)于NaCl溶液中的细胞杂质;“加蒸馏水使DNA析出→过滤得过滤物”的目的是除去可溶(可溶、不溶)于NaCl溶液中的细胞杂质。4.(记忆)DNA的析出:DNA滤液与等体积冷却酒精混合,静置一段时间后析出的白色丝状物就是DNA。5.(记

7、忆)DNA的鉴定:取2支洁净的试管,编号甲、乙,各加入等量的2mol/LNaCl溶液。甲中放入少量白色丝状物,使之溶解。在甲、乙试管中各加4mL二苯胺,混合均匀。沸水浴5min,观察颜色变化,甲试管呈现蓝色。三、操作提示【活动3】(记忆)阅读教材P56“操作提示”和P57“课题延伸”,关注下列注意事项:1.在鸡血中加入柠檬酸钠防止凝固;鸡血静置或离心后除去血浆,以提高细胞悬液浓度。2.实验中使用塑料烧杯和尼龙布,以免DNA被吸附。3.玻棒沿同一方向缓慢搅拌(细胞破裂时快速搅拌),玻棒不要碰到烧杯壁。4

8、.二苯胺试剂要现用现配。..5.为提高DNA纯度,实验中通常使用的洗涤剂有CTAB、SDS等。【活动4】观看视频:观看“DNA的粗提取与鉴定”视频,体会并学会相关技术方法。〖课后学习〗1.尝试从植物组织中提取DNA分子。2.基础训练册:将基础知识整理到作业本上;完成该节训练题。〖学习要求〗尝试PCR技术的基本操作,体验PCR技术的分子生物学实验方法;理解PCR技术的原理;讨论PCR技术的应用【预习指导】在课前时间通过阅读教材、同学交流和讨论,完成下列问题

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