重组人胰岛素制备工艺中大肠杆菌破碎方法选择 毕业论文

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1、重组人胰岛素制备工艺中大肠杆菌破碎方法选择RecombinanthumaninsulinproductionprocessE.colibrokenmethodchoice1摘要重组人胰岛素的生产，目前通过重组基因工程菌的发酵，以菌体的代谢，来合成人胰岛素[1]。所应用的工程菌种一般是大肠杆菌类，其目标蛋白在胞内表达，形成包涵体。一般生产工艺流程是通过目标基因的提取，制备工程菌，通过发酵扩大培养（形成大量的菌体），再通过浓缩，洗菌，破碎，复性，纯化，结晶，再结晶，冻干，收集晶体等步骤。其中菌体破碎是提取胞内产物的关

2、键性步骤。其破碎率的大小，将直接影响一下工艺中的最终胰岛蛋白的得率。所以，提高菌体破碎率，将会提高包涵体的收集，有利于提高胰岛素的得率。大肠杆菌再生产过程中，由于其质粒引入的人胰岛素基因是外援基因，且大肠杆菌是原核生物，目标蛋白是胞内表达，并形成水不溶性的包涵体。细胞破碎的目的是释放出细胞内含物（包涵体），其方法很多，按照是否存在外加作用力可分为机械法和非机械法。机械法（高压匀浆器、高速珠磨机、超生波振荡器等）；非机械法（酶解法、渗透压冲击法、冻结-融化法、化学法等）。机械法需要专用设备，利用机械的作用将细胞切碎

3、，所以细胞碎片细小、胞内物质一般都会释放出来。因此，造成细胞浆液中的核酸、杂蛋白含量较高，料液黏度大；但是，设备的通用性较强，破碎效率高，操作时间短，成本低，大多数的机械破碎法都适合大规模工业化生产。非机械法通过化学试剂或物理变化等因素来破坏细胞壁或其通透性的。破菌的条件比较温和，细胞的破碎率较低，胞内物释放的选择性好，固液分离容易，但耗费时间长，某些方法成本比较高，而且操作较为复杂。。关键词：菌体破碎，机械法与非机械法2文献综述：2.1工程菌种概况大肠杆菌通过基因工程，由人体细胞DNA中提取人胰岛素基因，与细菌

4、中质粒结合后，重新导入细菌中形成一种能够是目标基因表达而产生人胰岛素蛋白的菌种，这类菌被称为工程菌。工程菌在发酵扩大培养时，由于其目的基因上有阻遏基因，产生阻遏蛋白，是目的基因无法表达，因此在没有诱导物的时候，菌体几乎不表达。为了获得目标产物，人们使用乳糖或者IPTG等诱导物进行诱导菌体，目标基因大量表达才能大量表达，形成包涵体，因为在大肠杆菌中表达的真核基因产物往往都以包涵体形式存在于大肠杆菌浆液中[2]，所以要进行菌体破碎，才能获得包涵体。包涵体形成的原因：研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形

5、成包涵体[3]。所形成的包涵体可能是因为蛋白合成过快，以至于没有足够的时间进行有效的空间折叠，无法形成有活性的蛋白。重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，真核蛋白无法糖基化使中间体溶解度下降，导致不溶解包涵体形成。有报道认为，丰富的培养基有利于活性蛋白质的表达，当培养条件不佳时，容易形成包涵体[4]。工程菌大肠杆菌的细胞壁：大肠杆菌是革兰氏阴性菌，其细胞壁位于菌体最外层，厚约11um，分为两层，即外膜和肽聚糖层。外膜是大肠杆菌细胞壁的主要成分，占细胞壁于重的80％，厚约8nm，位于肽聚糖层的外侧，主要由磷脂、蛋白质和脂多

6、糖组成。肽聚糖层较薄，约2~3nm，占细胞壁成分的10%左右，肽聚糖之间仅由四肽侧链直接连接，缺乏五肽桥，故层较疏松，且肽聚糖居于细胞壁最内层，紧贴于细胞膜上[5]。细菌破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，其网状结构的致密程度和强度取决于多糖链上所存在的肽键数量和其交联的程度。交联程度越大，网状结构就越致密，破碎的难度也就越大。2.2破碎方法介绍与分析（细胞破碎的方法可分为两种：即机械法和非机械法）2.2.1机械法：⑴高压匀浆器（highpressurehomogenizer），高压匀浆器是常用的破碎装置。其工

7、作原理：高压匀浆器又名高压匀浆机、高压均化机、高压乳化泵。它是一种用途广泛的破碎、乳化设备。高压匀浆器一般有一个或几个往复运动的柱塞。一半多柱塞的往复泵其一对一的对应各自的工作室，个工作室互不相连，但进料管和排料管相通。个工作室并联在一起，做往复运动。依靠着柱塞的运动的配合，各单向阀门把处理的物料吸入泵腔内进行高压压缩。一般最高可达10000Kg／CM2，这些被压缩的物料经过一个或几个可调节的限制阀口，以很高的线速度由阀口喷出。撞击在特殊材料制成的圆环上，产生了三种效应：第一是空穴效应，被柱塞压缩的料液高压物料的

8、内部产生了很大的能量，料液通过阀口时，突然失压，物料内部的巨大能量被释放出来，形成气泡，引起空穴爆炸，形成空穴效应；第二是碰撞效应，通过阀口的物料有极高的流速，这些高速喷射的物料将会强烈的撞击在一个坚硬的圆环上，产生破碎；第三个效应是剪切效应，物料通过泵腔内的通道和阀口的狭缝时会产生剪切效应，另外由于混悬液各流层之间的流速不同，各层之间还会产生内部的剪切。通过这三种效应，