用重组人胰岛素原类似物免疫制备抗胰岛素单克隆抗体

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1、用重组人胰岛素原类似物免疫制备抗胰岛素单克隆抗体【摘要】目的制备抗胰岛素单克隆抗体（mAb）。方法用重组人胰岛素原类似物免疫BALB/c小鼠制备免疫脾细胞，运用淋巴细胞杂交瘤技术将其与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合。结果建立了7株分泌抗胰岛素mAb的杂交瘤细胞系，命名为A、B、C、D、E、F和G；7株mAb的Ig亚类分别为IgM、IgM、IgM、IgG2b、IgG1、IgG1和IgG1；在夹心ELISA试验中，7株mAb均能与人、牛和猪胰岛素发生特异性免疫反应；在免疫印迹试验中，7株mAb均能与重组人胰岛素原类似物结合呈现一条蛋白印迹带。结论7株mAb对

2、人、牛和猪胰岛素均具有免疫反应性，可用于人和动物胰岛素的测定和纯化。【关键词】单克隆抗体（mAb）；胰岛素；重组人胰岛素原类似物Developmentofmonoclonalantibodiesagainstinsulinbyimmunizationanproinsulinanalog【Abstract】ObjectiveTopreparemonoclonalantibody(mAb)againstinsulinMethodsSpleencellsfromBALB/cmiceimmunizedanproinsulinanalogyelomacellsb

3、yusinghybridomatechniques.ResultsSevenhybridomassecretingmAbagainstinsulinAbAbcouldspecificallyreacthuman,cattleorpiginsandAbanproinsulinanalogedbyimmunoblottingassay,onlyonestainedproteinbandappearedonthetransferredfilm.ConclusionThesevenmAbareimmunologicalspecifictoinsulinderi

4、vedfromhuman,cattleorsonoclonalantibody(mAb);insulin;rebinanthumanproinsulinanalog胰岛素是具有重要生理功能的一种多肽类激素，在治疗糖尿病方面具有重要用途。胰岛素抗体是胰岛素测定和纯化所必需的免疫学试剂。为此进行了本研究。1材料与方法1.1菌种、质粒和细胞大肠杆菌JM109、小鼠骨髓瘤SP2/0细胞系、含有λ噬菌体PRPL串联启动子的人胰岛素原类似物（BKRA）基因表达质粒pBV-BKRA由本课题组构建和保存〔1〕。1.2免疫血清的制备收集大肠杆菌JM109培养物，离心沉淀

5、菌体，用超声波破碎，加福氏佐剂乳化后，经皮下注射免疫兔，制备JM109免疫血清。1.3重组人胰岛素原类似物的制备用pBV-BKRA转化JM109〔1〗。取单个菌落，30℃培养14h，以20%接种在含卡那霉素（Kan）的新鲜LB培养液中，42℃振荡培养4h，高速离心沉淀菌体。参照文献〔2〗分离包涵体，用二硝基苯磺酸钠处理〔3〗后作为BALB/c小鼠免疫抗原。1.4免疫鼠将制备的重组人胰岛素原类似物与等量福氏完全佐剂混合乳化，经腹腔注射免疫6周龄的BALB/c小鼠，20mg/（次·只），免疫2次，间隔2周。在细胞融合前3～4天,加强免疫1次。1.5细胞融合

6、参照文献〔4〗，用免疫的BALB/c小鼠制备脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合。1.6杂交瘤细胞的筛选与克隆化采用间接抑制ELISA方法。用重组人胰岛素原类似物包被ELISA反应板，10%的JM109免疫血清封闭，加入杂交瘤细胞培养上清液与之反应，再与辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗鼠IgG反应，显色。从两次检测均为阳性的杂交瘤细胞孔中选取7个阳性孔，用有限稀释法进行克隆化。1.7单克隆抗体的制备将单克隆化的阳性杂交瘤细胞扩大培养，按5×106/只的细胞量注射于7～10天前预先腹腔注射无菌液状石蜡的BALB/c小鼠腹腔内，诱生腹水，制备mAb。1

7、.8单克隆抗体的效价用重组人胰岛素原类似物包被ELISA反应板，以常规间接ELISA分别测定各单克隆化的杂交瘤细胞培养上清液和诱生腹水中的mAb效价。1.9单克隆抗体的鉴定1.9.1亚类将浓缩10倍以上的杂交瘤细胞培养上清液或杂交瘤细胞诱生腹水，用抗鼠Ig亚类血清（Sigma产品），以琼脂双扩散试验鉴定mAb的亚类。1.9.2特异性1.9.2.1夹心ELISA用7株mAb作为捕捉抗体分别包被ELISA反应板，以人胰岛素（Sigma产品）、牛胰岛素（Sigma产品）、猪胰岛素（南京生化制药厂产品）作为被捕捉物分别与之反应，再加入辣根过氧化物酶（HRP）标

8、记的抗胰岛素单克隆抗体（Sigma产品）反应显色，检验7株mAb能否捕捉胰岛素。1.9.2.2