用重组人胰岛素原类似物免疫制备抗胰岛素单克隆抗体论文

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1、用重组人胰岛素原类似物免疫制备抗胰岛素单克隆抗体论文【摘要】目的制备抗胰岛素单克隆抗体（mAb）。方法用重组人胰岛素原类似物免疫BALB/c小鼠制备免疫脾细胞，运用淋巴细胞杂交瘤技术将其与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合。结果建立了7株分泌抗胰岛素mAb的杂交瘤细胞系，命名为A、B、C、D、E、F和G；7株mAb的Ig亚类分别为IgM、IgM、IgM、IgG2b、IgG1、IgG1和IgG1；在夹心ELISA试验中，7株mAb均能与人、牛和猪胰岛素发生特异性免疫反应；在免疫印迹试验中，7株mAb均能与重组人

2、胰岛素原类似物结合呈现一条蛋白印迹带。结论7株mAb对人、牛和猪胰岛素均具有免疫反应性，可用于人和动物胰岛素的测定和纯化。【关键词】单克隆抗体（mAb）；胰岛素；重组人胰岛素原类似物Developmentofmonoclonalantibodiesagainstinsulinbyimmunizationanproinsulinanalog【Abstract】ObjectiveTopreparemonoclonalantibody(mAb)againstinsulinMethodsSpleencellsf

3、romBALB/cmiceimmunizedanproinsulinanalogyelomacellsbyusinghybridomatechniques.ResultsSevenhybridomassecretingmAbagainstinsulinAbAbcouldspecificallyreacthuman,cattleorpiginsandAbanproinsulinanalogedbyimmunoblottingassay,onlyonestainedproteinbandappearedon

4、thetransferredfilm.ConclusionThesevenmAbareimmunologicalspecifictoinsulinderivedfromhuman,.freelonoclonalantibody(mAb);insulin;rebinanthumanproinsulinanalog胰岛素是具有重要生理功能的一种多肽类激素，在治疗糖尿病方面具有重要用途。胰岛素抗体是胰岛素测定和纯化所必需的免疫学试剂。为此进行了本研究。1材料与方法1.1菌种、质粒和细胞大肠杆菌JM109、小鼠

5、骨髓瘤SP2/0细胞系、含有λ噬菌体PRPL串联启动子的人胰岛素原类似物（BKRA）基因表达质粒pBV-BKRA由本课题组构建和保存［1］。1.2免疫血清的制备收集大肠杆菌JM109培养物，离心沉淀菌体.freelg/（次·只），免疫2次，间隔2周。在细胞融合前3～4天,加强免疫1次。1.5细胞融合参照文献［4〗，用免疫的BALB/c小鼠制备脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合。1.6杂交瘤细胞的筛选与克隆化采用间接抑制ELISA方法。用重组人胰岛素原类似物包被ELISA反应板，10%的JM109免疫

6、血清封闭，加入杂交瘤细胞培养上清液与之反应，再与辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗鼠IgG反应，显色。从两次检测均为阳性的杂交瘤细胞孔中选取7个阳性孔，用有限稀释法进行克隆化。1.7单克隆抗体的制备将单克隆化的阳性杂交瘤细胞扩大培养，按5×106/只的细胞量注射于7～10天前预先腹腔注射无菌液状石蜡的BALB/c小鼠腹腔内，诱生腹水，制备mAb。1.8单克隆抗体的效价用重组人胰岛素原类似物包被ELISA反应板，以常规间接ELISA分别测定各单克隆化的杂交瘤细胞培养上清液和诱生腹水中的mAb效价。1.9单

7、克隆抗体的鉴定1.9.1亚类将浓缩10倍以上的杂交瘤细胞培养上清液或杂交瘤细胞诱生腹水，用抗鼠Ig亚类血清（Sigma产品），以琼脂双扩散试验鉴定mAb的亚类。1.9.2特异性1.9.2.1夹心ELISA用7株mAb作为捕捉抗体分别包被ELISA反应板，以人胰岛素（Sigma产品）、牛胰岛素（Sigma产品）、猪胰岛素（南京生化制药厂产品）作为被捕捉物分别与之反应，再加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗胰岛素单克隆抗体（Sigma产品）反应显色，检验7株mAb能否捕捉胰岛素。1.9.2.2免疫印迹试验采

8、用免疫印迹法［5〗分析。重组菌诱导表达后，将菌体进行SDS-PAGE，电泳转移到硝酸纤维素膜上，用7株mAb分别与转移膜反应后，再加碱性磷酸酶（AP）标记的山羊抗鼠IgG与转移膜反应，显色。实验同步设立JM109菌与pBV220转化菌对照。2结果2.1重组人胰岛素原类似物的制备用SDS-PAGE和凝胶扫描分析，包涵体中重组人胰岛素原类似物的含量达到80%（图1）。图1pBV-BKRA的诱导表达与mAb表达（略）2.2细胞融合与克隆化融合细胞