重组细小病毒对胶质瘤细胞的生长抑制作用

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1、重组细小病毒对胶质瘤细胞的生长抑制作用【摘要】　　［目的］研究表达趋化因子MIP-1α/LD78β的重组细小病毒对胶质瘤细胞的生长抑制作用。［方法］共转染法制备重组病毒。用重组病毒感染人胶质瘤细胞系U87MG以及鼠胶质瘤细胞系GL261，监测细胞生长并用ELISA方法测定细胞培养上清中MIP-1α蛋白每日和累积表达量。克隆形成实验测定病毒的细胞毒性。［结果］与未处理的细胞相比，MOI=3RU/cell的重组病毒感染使GL261细胞克隆形成减少。U87MG和GL261细胞感染重组病毒后均可产生大量MIP-1α蛋白。日表达量的高峰分别出现在感染后第3d和第4d。2×105的GL261和U87M

2、G细胞在感染（MOI=3）5d后累积蛋白表达量分别为780ng/ml和250ng/ml。和对照相比，重组病毒感染的GL261细胞生长减慢，但表达MIP-1α或LD78β的重组病毒与不含外源基因的重组病毒感染GL261后，活细胞数目没有明显差异。U87MG对病毒的敏感性低于GL261，感染重组病毒的各组细胞生长比对照略缓慢。［结论］重组细小病毒在体外对U87MG和GL261胶质瘤细胞的生长有抑制作用，但转导外源基因MIP-1α/LD78β在体外对细胞生长无明显影响，抑制作用主要是由于病毒的细胞毒性引起。【关键词】重组细小病毒　胶质瘤细胞　细胞毒性　生长抑制　　GroaCellsafterIn

3、fectionmelaere赠送。其他细胞为本室保存。1．2方法1.2.1细胞培养293T、GL261和U87MG细胞在含10%小牛血清、2mML-谷氨酸和抗生素的DMEM中培养，A9和NBE-324K在10%小牛血清，2mML-谷氨酸和抗生素的MEM中培养。培养条件为37℃，5%CO2，90%湿度。1.2.2重组病毒制备培养1×108293T细胞，磷酸钙法转染300μgH1(hH1/MIP-1α，hH1/LD78β和hH1/Δ800)和MVM重组病毒质粒，(MVMp/MIP-α，MVMp/LD78β，MVMp/Δ800)及其相应的600μg包装辅助质粒，72h时后收获细胞,冻融法制备病毒

4、粗提物，碘克沙醇（iodixanol）梯度离心纯化，病毒分别感染SV40转化的人胎肾细胞系NBE-324K和鼠成纤维细胞A9，用病毒DNA特异性探针杂交测定H1和MVM重组病毒的感染滴度（replicationunit，RU/ml）。1.2.3病毒感染和生长曲线感染的前一天在6cm细胞培养皿中培养2.5×105细胞，次日吸除培养液，加入0.4ml用不含血清的MEM稀释的病毒，病毒剂量为multiplicityofinfection(MOI)=3，置于37℃，5%CO2，90%湿度孵箱，每隔10min轻轻摇动培养皿1次，以确保细胞与病毒的接触。1h后吸除病毒，加入4ml含10%血清的培养液培

5、养5d，每天取出2盘细胞用台盼蓝染色计数，绘制生长曲线。1.2.4克隆形成实验测定病毒的细胞毒性在6cm细胞培养皿中培养2.5×105GL261细胞，次日进行病毒感染，病毒剂量为MOI=3，感染1h后吸除病毒，加入4ml含10%血清的培养液培养4h，用胰酶消化细胞并计数，在新的培养皿中分别加入100、500、1000、2000、4000、10000个细胞/皿，培养2周，吸出培养液，4℃用乙醇/醋酸（3∶1）固定细胞20min，70%乙醇和清水洗涤，加结晶紫染色30min，清水洗涤后计细胞克隆数。1.2.5趋化因子表达测定培养2.5×105U87MG和GL261细胞，分别用MOI=3的重组H

6、1和MVM病毒感染1h，继续培养5d，每天收集一盘细胞的培养上清，ELISA测定蛋白的累积表达量。日表达量的测定每天从同一盘细胞中收集培养液，并更换新培养液。2结果2.1病毒制备收集感染了病毒3d后的293T细胞，37℃10min，－80℃30min反复冻融3次，离心收集上清为病毒粗提物，病毒粗提物用碘克沙醇梯度离心进行纯化后，感染A9（MVM病毒）和NBE-324K（H1病毒）细胞，48h后将细胞转移至硝酸纤维素膜上，经变性和中和后，用病毒基因组特异性NS探针杂交，测定病毒感染性滴度，得到感染滴度为9×106RU/ml~1×108RU/ml的重组病毒。2.2病毒的细胞毒性由于U87MG细

7、胞不形成克隆，因此仅测定了MVM重组病毒对GL261细胞的毒性。克隆形成实验结果表明，MOI=3RU/cell的重组MVMp病毒减少GL261细胞克隆形成，MVMp/MIP-1α，MVMp/LD78β，MVMp/Δ800病毒感染细胞的克隆形成率与对照(视为100%)相比分别降至61%、76%和71%。含趋化因子的重组病毒与不含外源基因(Δ800)的病毒相比，对细胞的毒性没有差异。2.3病毒感染后细胞生长曲线和对照相比，M