新城疫病毒对血管生长的抑制作用论文

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1、新城疫病毒对血管生长的抑制作用论文【摘要】目的研究鸡新城疫病毒对血管的生长抑制作用。方法采用小鼠肺癌转移模型观测鸡新城疫病毒（NDV）对癌细胞转移的影响及组织内微血管的生长情况；用体外药物敏感实验（MTT）检测NDV在不同剂量和作用时间下对人血管内皮细胞ECV304细胞的增殖抑制效应；用PI和Hoechst33342进行荧光染色检测NDV作用后细胞有无凋亡改变及其形态学变化。结果NDV在体内可以有效抑制小鼠发生癌转移时组织内微血管的生成，在体外可以抑制ECV304细胞的增殖并导致较为轻微的凋亡现象。结论体内外实验均表明NDV可以抑制肿瘤发生时微血管的生长，这一作用通过抑制血管内皮细胞的

2、增殖而非直接的细胞毒作用实现，该作用机制可能与某种特定病毒蛋白有关，尚待进一步研究。【关键词】NDV；血管生成抑制剂；肺转移Groonarymetastasis肿瘤生长依赖从生长环境中获得营养并向环境排泄代谢产物，当肿瘤细胞的量较为少时，其与环境之间的物质交换可以通过弥散的方式来完成，但是.freelL青霉素、100μg/mL链霉素的RPMI1640培养基，在37℃5%CO2的培养箱中培养；试剂：RPMI1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶均为Gibco产品；四甲基偶氮盐（34，5dimethyl2thiazoly12,5diphenyltetrazoliumbromi

3、de）、Hoechest33342、碘化丙啶（PropidiumIodide）均为Sigma产品；HPIAS1000高清晰度彩色病理图文分析系统（清屏影像技术有限公司）1.2实验方法1.2.1病毒的复壮与收集将新城疫病毒Lasoda株活疫苗（NDVL）接种于9日龄鸡胚尿囊腔培养48～72h，收集尿囊液，测得血凝效价为1∶640，分装于无菌离心管中，-20℃保存。1.2.2肺转移动物模型的建立取接种7天左右的种鼠，颈椎脱臼处死后抽取腹水，用生理盐水稀释至2.5×106/mL。经尾静脉注射接种瘤细胞，每鼠0.2mL2。1.2.3抗肿瘤转移实验将接种后的小鼠随机分为空白对照组及治疗组，每

4、组10只。接种后24小时起腹腔给药（血凝效价1∶640，0.2mL/只），每3天给药一次，对照组给等量PH7.2的PBS，共给药5次。接种后第15天颈椎脱臼处死小鼠，解剖取肺并检查有无其他脏器及部位的转移。肺组织常规固定、包埋、切取最大截面计数转移灶数，并观察肺组织内血管的生长情况。1.2.4MTT法检测NDV对人血管内皮细胞ECV304的作用取对数生长期细胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基稀释为2×106/mL，接种于96孔板中，每孔100μL，之后依次加入用PH7.2的PBS10倍梯度稀释的NDV和阴性对照组，并保留仅加培养基的空白组。随后在37℃5%CO2的培养箱中连

5、续培养24h、36h，然后每孔加入10μL5mg/mL的MTT溶液，连续培养4小时。吸去上清，每孔加入100μLDMSO，在570nm波长处用酶标仪测OD值。用下面的公式计算细胞增殖抑制率3：细胞增殖抑制率=OD空白-OD样品OD空白×100%1.2.5荧光显微镜检测药物对ECV304细胞核形态学特征的影响分别将Hoechst33342和碘化丙啶（PI）配成100μg/mL的母液，用前等量混合。细胞经1∶4NDV处理16h、24h、48h后分组收集。每个标本取200μL移入EP管中，加入荧光染料Hoechst33342至终浓度10μg/mL，碘化丙啶（PI）20μg/mL，37℃下染色

6、15min，取20μL细胞悬液迅速滴于载玻片上，加盖玻片，紫外光激发，在荧光显微镜下观察可见4种细胞形态，活细胞（VN）染为蓝色，核呈正常结构；早期凋亡细胞（VA）染为蓝色，核呈固缩状或圆珠状；非凋亡的死亡细胞（NVN）染为红色，核呈正常结构；晚期凋亡细胞（NVA）也染为红色，但可见明显的染色质凝聚，细胞凋亡率可由以下公式计算4：凋亡率=VA+NVAVN+NVN+VA+NVA×100%2结果2.1鸡新城疫病毒对小鼠肺血管生成的影响S180肉瘤尾静脉内接种以形成肺转移灶为主，亦有其他部位的转移。10只对照组小鼠肺表面及肺内均出现直径0.5～2.0mm的粒状转移灶，肺组织颜色深红，有明显的

7、充血症状（图略），其中出现胸膜黏连3只，腹膜、腋下转移性包块2只。治疗组肺组织发白，除2只肉眼可见极小的转移灶外，其余均为镜下转移灶（图略）。光镜下S180肉瘤实验性肺转移对照组的转移灶内及周围血供丰富，瘤细胞密集，生长旺盛，有明显的血管增生扩张、充血和出血，一些血管腔内有从转移灶侵入的瘤细胞。并见大片坏死区，见图1，此外，对照组肝脏也可见少量散在的转移灶。NDV组小鼠肺内也见散在的小转移灶，其中有散在的凋亡细胞。未见血管扩张、充血，无血管长入