选育紫杉醇高产菌种链格孢单孢变种论文

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1、选育紫杉醇高产菌种链格孢单孢变种论文段丽丽陈鸿锐陈杰鹏李卫潘洪琳【摘要】以从红豆杉树皮中分离得到的高产紫杉醇(paclitaxel)菌株013为出发菌株，采用紫外线诱变、亚硝基胍诱变交替进行的方法，同时复合含1%乙酰胺的理性化筛选模型，获得一株遗传性状稳定的链格孢单孢变种ST026，摇瓶发酵产量可稳定达到227mg/L，比出发菌株产量提高81.6%。【关键词】紫杉醇；诱变；链格孢单孢变种；理性化筛选ABSTRACTThestartingstrainAlternariaalternate013,isolatedfromthebarkoftaxusyunnanensis,isahigh

2、yieldpaclitaxelproducingstrain.ThisstrainisundergonemutationbyUVandNTGinteractively.binediderationalscreeningmodel,.freeledasAlternariaalternatevar.monosporusST026.Thestableproductivityofpaclitaxelisupto227mg/Linflaskcultureonosporus;Rationalscreening紫杉醇是最有效的抗癌药物之一，已有15年历史。为解决其来源问题，紫杉醇生产技术历经

3、四代更替：第一代技术为从红豆杉树皮中提取纯化；第二代技术为以大量红豆杉种植园为支撑.freelg，硫酸亚铁2mg，三氯化铁1mg，碘化钾1.4mg，硼酸1mg，VB110mg，蒸馏水1000ml；pH6.8，25℃，175r/min，摇床培养38h。(4)发酵培养蔗糖50g，黄豆饼粉2.5g，酵母浸膏0.5g，硫酸镁0.6g，碳酸钙1g，硫酸锰0.7mg，硫酸亚铁2mg，三氯化铁1mg，碘化钾1.4mg，硼酸1mg，VB110mg，蒸馏水1000ml；pH6.8，25℃，175r/min，摇床培养8d。1.3菌种诱变与筛选(1)紫外照射单因子处理［4］用25℃恒温培养7d的成熟斜面

4、菌株作为出发菌株，制得单孢子悬液置平皿中，紫外灯(30CCNo.0899。2.4高产菌株遗传稳定性考察ST026菌株经连续五次斜面传代后与F1代进行生长速度、菌体形态、摇瓶发酵产量情况对比，结果表明经五代传代后菌体生长速度、菌体形态以及发酵产图4分离得到的产紫杉醇的野生菌013菌种形态(10×100)量与F1代基本一致。证明该菌株遗传稳定性良好。2.5高产菌株斜面4℃冰箱保藏稳定性考察ST026菌株转种于PDA斜面培养基，于25℃培养7d，于4℃冰箱恒温保藏。经活化传代后进行生长速度、菌体形态、摇瓶发酵产量情况对比，结果表明ST026菌株4℃冰箱中保藏45d，其形态和产量与原种一致

5、。提示4℃冰箱保藏的该菌株应在45d内使用。2.6高产菌株保藏稳定性考察ST026菌株采用冷冻干燥保藏方法，以脱脂奶为保护剂进行保藏。在保存后即刻、一个星期、一个月、两个月、三个月、半年、一年、两年、三年、五年等分别进行保藏稳定性考察。结果表明，经保藏后的菌株菌体生长速度、菌体形态以及发酵产量与原种基本一致。证明该菌株保藏稳定性良好。3讨论研究过程中发现，在含有1%乙酰胺的PDA培养基上，紫杉醇产生菌的高产形态特征表现明显，且产量提高幅度较大。原因可能是乙酰胺可以作为该微生物发酵生产紫杉醇的前体物质，因此在诱变过程中加入乙酰胺，提高了该菌株对乙酰胺的利用率，也提高产量。在紫外诱变复

6、合1%乙酰胺的理性化筛选过程中获得紫杉醇高产的单细胞突变株ST768。选用紫外诱变法和亚硝基胍诱变法交替进行的诱变处理，正突变株得率较高，产量提高幅度较大。利用ST026菌株发酵生产紫杉醇项目在国家各级政府部门的支持下，已完成小试阶段，目前产量可达227mg/L。ST026菌株发酵产物组分复杂，产量不高，还有大量工作要做。图5分离得到的产紫杉醇的野生菌013孢子电镜下形态图6诱变得到的紫杉醇高产菌株ST026菌种形态(10×100)【