选育紫杉醇高产菌种链格孢单孢变种

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1、选育紫杉醇高产菌种链格孢单孢变种作者：段丽丽陈鸿锐陈杰鹏李卫潘洪琳【摘要】以从红豆杉树皮中分离得到的高产紫杉醇(paclitaxel)菌株013为出发菌株，采用紫外线诱变、亚硝基胍诱变交替进行的方法，同时复合含1%乙酰胺的理性化筛选模型，获得一株遗传性状稳定的链格孢单孢变种ST026，摇瓶发酵产量可稳定达到227mg/L，比出发菌株产量提高81.6%。【关键词】紫杉醇；诱变；链格孢单孢变种；理性化筛选ABSTRACTThestartingstrainAlternariaalternate013,isolatedfromthebarkoftaxusyunnanensis,isahighyiel

2、dpaclitaxelproducingstrain.ThisstrainisundergonemutationbyUVandNTGinteractively.binediderationalscreeningmodel,edasAlternariaalternatevar.monosporusST026.Thestableproductivityofpaclitaxelisupto227mg/Linflaskcultureonosporus;Rationalscreening紫杉醇是最有效的抗癌药物之一，已有15年历史。为解决其来源问题，紫杉醇生产技术历经四代更替：第一代技术为从红豆杉树皮

3、中提取纯化；第二代技术为以大量红豆杉种植园为支撑，从红豆杉树叶中提取中间体10DAB，再经半合成而得；第三代技术为红豆杉植物细胞培养，从中提取纯化而得；第四代技术为微生物发酵技术。从发展的观点看，微生物发酵生产技术最具竞争力。作者从红豆杉树皮中分离、筛选到高产紫杉醇的真菌，再经菌种诱变、改造不断提高紫杉醇产生菌的产量和菌种的稳定性，取得了一定的效果。该研究成果已获得国家专利［1］、国际PCT专利［2］和美国专利［3］保护。1材料与方法　　1.1出发菌株链格孢013(Alternariaalternate013)由汕头市双骏生物工程有限公司从红豆杉树皮中分离获得，经中山大学生物工程研究中心运用

4、核糖体RNA基因分析鉴定为Alternariaalternate的不同株系。1.2培养基及培养条件(1)斜面培养马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基，25℃培养5～7d。(2)理性化筛选培养含1%乙酰胺的PDA培养基，25℃培养5～7d。(3)种子培养葡萄糖10g，蔗糖40g，黄豆饼粉3g，硫酸镁0.1g，碳酸钙1g，硫酸锰0.7mg，硫酸亚铁2mg，三氯化铁1mg，碘化钾1.4mg，硼酸1mg，VB110mg，蒸馏水1000ml；pH6.8，25℃，175r/min，摇床培养38h。(4)发酵培养蔗糖50g，黄豆饼粉2.5g，酵母浸膏0.5g，硫酸镁0.6g，碳酸钙1g，硫酸锰0.7mg，硫酸亚

5、铁2mg，三氯化铁1mg，碘化钾1.4mg，硼酸1mg，VB110mg，蒸馏水1000ml；pH6.8，25℃，175r/min，摇床培养8d。1.3菌种诱变与筛选(1)紫外照射单因子处理［4］用25℃恒温培养7d的成熟斜面菌株作为出发菌株，制得单孢子悬液置平皿中，紫外灯(30，距离30cm)照射3min，孢子液适当稀释后涂布于PDA平板培养基上。培养7d后挑取单菌落进行摇瓶筛选。(2)紫外线照射复合理性化筛选制备含有1%乙酰胺的PDA培养基平板，将UV处理过的孢子液适当稀释并涂布于含乙酰胺的平板培养基上，培养7d后挑选孢子丰富、色素深、菌落黑色边缘较大的菌落进行摇瓶筛选。(3)亚硝基胍单因子

6、处理［4］用25℃恒温培养7d的成熟斜面菌株作为出发菌株，用含0.1%葡萄糖、1mg硼酸的无菌水溶液制得单孢子悬液，置于三角瓶内，于25℃培养6～8h，使孢子萌发，离心弃上清得孢子沉淀，再用配制好的亚硝基胍溶液在避光环境下作用2h，亚硝基胍作用浓度为2mg/ml，作用终止后，孢子悬液适当稀释涂布于PDA平板培养基上。培养7d后挑取单菌落进行摇瓶筛选。(4)亚硝基胍作用复合理性化筛选制备含有1%乙酰胺的PDA培养基平板，将亚硝基胍处理过的孢子悬液适当稀释并涂布于含乙酰胺的平板培养基上，培养7d后挑选孢子丰富、色素深、菌落黑色边缘较大的菌落进行摇瓶筛选。1.4发酵终产物产量检测紫杉醇对照品为Sig

7、ma公司产品。(1)样品处理定量取发酵液，过滤得菌体，于55℃干燥，粉碎，用乙酸乙酯∶丙酮(1∶1)浸提3d，取有机相挥干溶剂得浸膏。(2)薄层色谱法展开剂为三氯甲烷∶乙醇(19∶1.5)，显色剂为乙醇∶浓硫酸(19∶1)。(3)HPLC检测外标法，固定相为C18柱(5μm)，流动相为70%甲醇，柱温30℃，检测波长227nm，流速为0.9ml/min。计算方法：样品的浓度=标准品浓度×标准品进样