定量分析结果与dna电泳条带法的定性分析结果对清髓性造血干细胞移植术后的测量

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1、定量分析结果与DNA电泳条带法的定性分析结果对清髓性造血干细胞移植术后的测量-->定量分析结果与DNA电泳条带法的定性分析结果对清髓性造血干细胞移植术后的测量【摘要】目的建立对非清髓性造血干细胞移植术后造血嵌合体的STR-PCR定量检测技术,初步探讨该技术在监测非清髓性造血干细胞移植术后植入状态中的应用。方法对3例非清髓性异基因造血干细胞移植术后的患者序列血样,在可区分供受者基因的STR位点上,代写医学毕业论文应用凝胶图像分析技术进行供受者特异性等位基因的定量分析。结果定量分析结果与DNA电泳条带法的定性分析结果,以及临床移

2、植效果一致。在电泳条带已表现为供者源造血时,通过定量分析仍可检测出受者特异性等位基因。结论STR-PCR定量分析技术较单纯电泳鉴定植入可观察到更为细微的变化,该法是检测非清髓性造血干细胞移植后供受者嵌合体更为有效的方法。【关键词】短片段串联重复非清髓性造血干细胞移植嵌合体【Abstract】ObjectiveToestablishamethodforquantitativeanalysisofmixedhematopoieticchimerism(MC)basedonSTRloci.MethodsUsingSTRtechni

3、quebinedplescollectedfrom3nonmyeloablativestemcelltransplantationrecipientsevery15daysaftertransplantation.ResultsThequantitativeresultscoincidedoresubtlechangesintheevi-denceofengraftment.Itisamoreefficientmethodfordetectthehematopoieticchimerismposttransplantatio

4、n.【KeyrepeatsNonmyeloablativestemcelltransplantationChimerism短片段串联重复(shorttandemrepeats,STR),又称微卫星(microsatellite),是一类高度多态性的遗传标记,突变率仅为5×10-4~5×10-5。本研究利用STR特性及图像分析技术,对3例非清髓性异基因造血干细胞移植术后的患者序列血样,进行了供受者特异性等位基因的定量分析,旨在建立造血嵌合体的STR定量检测技术,并探讨该技术对监测非清髓性造血干细胞移植后植入状态的作用。1对象与

5、方法1.1对象研究病例来自四川大学华西医院血液科2000年10月至2001年7月的非清髓性异基因造血干细胞移植者,共3例。其临床资料见表1。供、受者血样HLA基因配型采用SSP法,三例均为完全相合。受者预处理方案为:CD3单克隆抗体(AntiCD3)5mg/d,移植前第6至第2d静脉滴入;输前静脉滴入甲泼尼龙(MP)80mg;环磷酰胺(Cy)60mg/(kg·d),移植前第6、第5d静脉滴入。1.2方法1.2.1仪器和试剂GeneAmpPCRSystem9600PCR扩增仪;DYYⅢ286型电泳仪;DNA聚合酶购自大连宝生公

6、司rTaqTaKaRaPolymerase;凝胶成像分析采用IMAGEPROPLUS4.01软件。1.2.2标本的收集和处理移植前每例收集供受者外周血样各2ml,-20℃冰箱保存。移植后每15d收集一次受者外周血样,至受者达到可评价的终点(即移植成功或失败)时为止,共收集26份样本。样本DNA的提取采用酚/氯仿法[3]。1.2.3STR基因座的选择取移植患者移植前DNA样本和供者DNA样本,根据供受者所属人群中常见14个STR基因座分布特点及基因座多态性,选择对供受者有分辨意义的STR位点。本文中3例移植分别选择D9S111

7、8,D3S1358,和D5S818基因座。1.2.4STR位点PCR扩增根据3例所选的不同STR位点,扩增目标基因片段。所用引物见表2。1.2.5凝胶电泳定量分析取每份血样扩增的PCR产物3μl,进行非变性聚丙烯酰胺凝胶(凝胶浓度8%)电泳1.5h。电泳条带银染后,用凝胶扫描图像分析软件观察条带亮度值变化。根据亮度值按下列公式计算目标DNA的相对含量。2结果2.1PCR扩增条件设定每例均经过5次以上预实验调整扩增温度和时间,其设定的电泳条带效果最佳、杂带最少的PCR扩增条件见表3。2.2凝胶电泳图像分析结果病例1在D9S11

8、18位点上,供者的2个等位基因中有一个等位基因与受者不同,另一个等位基因与受者相同。分析发现,移植后15d,30d,45d,60d,75d,90d,120d,凝胶电泳显示受者有核细胞DNA在D9S1118位点上等位基因为3条带,形成嵌合体;移植后150d,显示受者在D9S1118位点上等位