ephrina1基因小干扰rna的构建及其在huh

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1、EphrinA1基因小干扰RNA的构建及其在Huh王怡，陈钢，陈必成，刘佳明，黄陈平【摘要】目的：构建针对EphrinA1基因的发夹状RNA（ShRNA）表达载体pSilencer2.1-EphrinA1-SiRNA，观察其对人肝癌细胞Huh-7中EphrinA1基因表达的特异性抑制效应。方法：设计合成针对EphrinA1mRNA的RNAi核苷酸片段，并定向克隆到pSilencer2.1-U6载体中，构建重组质粒pSilencer2.1-EphrinA1-SiRNA.freelRNA表达较pSilencer2.1-EphrinA1-ScrRN

2、A组和空白对照组明显下调，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：pSilencer2.1-EphrinA1-SiRNA载体的成功构建为下一步研究以EphrinA1基因为靶位点的肝细胞癌基因治疗奠定了重要的实验基础。【关键词】EphrinA1；小干扰RNA；肝细胞癌Abstract:Objective:ToobservetheinhibitioneffectofShRNAonEphrinA1expressioninhepatomacelllineHuh-7throughconstructionoftheexpressedcarrierpSil

3、encer2.1-EphrinA1-ScrRNAofEphrinAI.Methods:TRNAsequenceinGenBank，andthenidstocreaterebinantplasmidspSilencer2.1-EphrinA1-SiRNAandpSilencer2.1-EphrinA1-ScrRNA(control).AfterbeingtransfectedintoHuh-7cells，EphrinA1expressedbyShRNAsidsidsids(P＜0.05）.Conclusion:Con-structionofpS

4、ilencer2.1-EphrinA1-SiRNAlaysanimportantexperimentalfoundationforgenetherapyofhepatocellularcarcinoma(HCC)bytargetingtheEphrinA1gene.Keybion公司；T4连接酶及各种限制性核酸内切酶均购自美国Promega公司；脂质体Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司；质粒提取试剂盒、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）试剂盒购自TaKaRa公司；RT-PCR引物由上海生工合成。1.2Ephri

5、nA1-siRNA转录模板的发夹结构设计将EphrinA1的mRNA全序列（GenBankNM_004428）输入到SiRNASepuenceSelector中，筛选出一个19nt的靶序列，阴性对照将SiRNA片段顺序打乱。SiRNA靶序列为5’-ACCACAGGCATAAGCTATC-3’，ScrambleSiRNA靶序列为5’-CACACCATAATAAGGGTCC-3’。然后用SiRNAHairpinOligonucleotideSequenceDesigner软件设计成能与pSilencer2.1载体相连接的双链发夹结构。序列结构为B

6、amHI+sense+loop+antisense+终止信号+SalI+HindIII。实验组DNA模板序列为：5’-ACCACACCACAGGCATAAGCTATCTTCAAGAGAGATAGCTTATGCCTGTGGTTTTGCAATTCACAGCTT-3’3’-TGGTGTGGTGTCCGTATTCGATAGAAGTTCTCTCTATCGAATACGGACACCAAAACGTTAAGTGTCGAA-5’阴性对照组DNA模板序列为：5’-ACCACACCACGAGCATAAGCTATCTTCAAGAGAGATAGCTTATGCTCGTGG

7、TTTTGCAATTCACAGCTT-3’3’-TGGTGTGGTCTGCGTATTCGATAGAAGTTCTCTCTATCGAATACGGCCACAAAAACGTTAAGTGTCGAA-5’交由上海博亚公司合成。1.3插入片段的退火和连接将合成的寡核苷酸链溶解在ddH2O中，各取1μL正义和反义寡核苷酸链溶液，再加入48μL退火缓冲液，充分混匀，配制成50μL溶液，在PCR仪上95℃孵育4min，70℃孵育10min，缓慢冷却至4℃；以HindIII，BamHI双酶切pSilencer2.1-U6质粒，使载体线性化，取退火后的插入片段溶液1

8、μL+线性化pSilencer2.1-U6质粒5μL+T4连接酶2μL+T4连接酶缓冲液2μL在4℃下过夜。分别命名为pSilencer2.1-EphrinA1-S