ephrina1基因小干扰rna的构建及其在huh-7细胞中的沉默效应

《ephrina1基因小干扰rna的构建及其在huh-7细胞中的沉默效应》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、EphrinA1基因小干扰RNA的构建及其在Huh-7细胞中的沉默效应作者：王怡，陈钢，陈必成，刘佳明，黄陈平【摘要】目的：构建针对EphrinA1基因的发夹状RNA（ShRNA）表达载体pSilencer2.1-EphrinA1-SiRNA，观察其对人肝癌细胞Huh-7中EphrinA1基因表达的特异性抑制效应。方法：设计合成针对EphrinA1mRNA的RNAi核苷酸片段，并定向克隆到pSilencer2.1-U6载体中，构建重组质粒pSilencer2.1-EphrinA1-SiRNA，同时构建不针对任何序列的重组质粒pSilencer2.1-EphrinA1-ScrRNA，通过脂

2、质体介导转染入Huh-7细胞，应用逆转录聚合酶链反应检测小干扰RNA的沉默效应。结果：酶切鉴定证实pSilencer2.1-EphrinA1-SiRNA和pSilencer2.1-EphrinA1-ScrRNA重组质粒构建成功，转染Huh-7细胞后，pSilencer2.1-EphrinA1-SiRNA组EphrinA1mRNA表达较pSilencer2.1-EphrinA1-ScrRNA组和空白对照组明显下调，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：pSilencer2.1-EphrinA1-SiRNA载体的成功构建为下一步研究以EphrinA1基因为靶位点的肝细胞癌基因治疗奠定了重要

3、的实验基础。【关键词】EphrinA1；小干扰RNA；肝细胞癌　　Abstract:Objective:Toobservetheinhibitioneffect10ofShRNAonEphrinA1expressioninhepatomacelllineHuh-7throughconstructionoftheexpressedcarrierpSilencer2.1-EphrinA1-ScrRNAofEphrinAI.Methods:TwopairsofSiRNAweredesignedandsynthesizedaccordingtotheEphrinA1mRNAsequenceinG

4、enBank，andthenwereinsertedintopSilencer2.1-U6plasmidstocreaterecombinantplasmidspSilencer2.1-EphrinA1-SiRNAandpSilencer2.1-EphrinA1-ScrRNA(control).AfterbeingtransfectedintoHuh-7cells，EphrinA1expressedbyShRNAswasdetectedtobedownregulatedbyRT-PCR.Results:Allplasmidswereconstructedsuccessfully.Expr

5、essionofEphrinA1inHuh-7cellsinfectedwithpSilencer2.1-EphrinA1-SiRNAplasmidswassignificantlydownregulatedcomparedwiththatisinfectedwithpSilencer2.1-EphrinA1-ScrRNAplasmids(P＜0.05）.Conclusion:Con-structionofpSilencer2.1-EphrinA1-SiRNAlaysanimportantexperimentalfoundationforgenetherapyofhepatocellul

6、arcarcinoma(HCC)bytargetingtheEphrinA1gene.　　Keywords:EphrinA1；SiRNA；HCC10　　受体酪氨酸激酶已经被公认为血管生成的重要信号分子，Ephrin配体及其受体Eph是其中最大的一个亚家族，其在肿瘤血管生成中的作用受到越来越多的关注[1]。近期有日本学者用cDNA微列阵分析显示EphrinA1在AFP相关的肝细胞癌中是最多过度表达的基因[2]。我们的前期研究也表明，在人肝癌组织切片中EphrinA1蛋白的表达明显增高并与其血管生成明显相关；EphrinA1的高表达与肿瘤的转移侵袭能力密切相关[3]。本实验拟构建靶向Ephr

7、inA1基因的RNA干扰重组体，通过沉默Huh-7肝癌细胞中EphrinA1基因的表达，以期为下一步探讨EphrinA1基因在肝细胞癌发生、发展及血管生成中的作用提供有力支持。　　1材料和方法　　1.1材料　　Huh-7肝癌细胞株由湖南湘雅中心实验室提供；质粒pSilencer2.1-U6购自美国Ambion公司；T4连接酶及各种限制性核酸内切酶均购自美国Promega公司；脂质体Lipofectamine2000购自美国Invit