5株第一类整合子阳性铜绿假单胞菌的耐药机制分析

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1、5株第一类整合子阳性铜绿假单胞菌的耐药机制分析作者：肖增璜刘菊珍付强石磊【摘要】目的了解5株分离于临床的第一类整合子阳性铜绿假单胞菌分子生物学特点。方法应用PCR的方法确定5株铜绿假单胞菌含有第一类整合子并且对其整合耐药基因盒进行扩增和测序，通过PFGE分析该5株菌的同源性。结果5株铜绿假单胞菌均为第一类整合子阳性菌株并且都携带2360bp的耐药基因盒，包括aacA4和含有终止突变的cmlA1。PFGE结果显示5株铜绿假单胞菌来自同一克隆。结论整合子在临床致病菌的多重耐药性中起着重要作用，本研究提示

2、应加强细菌耐药性的监测以及防止相关病菌在院内的传播。【关键词】整合子；铜绿假单胞菌；PFGE目前，对细菌耐药机制的研究已成为研究的热点。携带耐药基因是细菌显示耐药性的重要原因之一。耐药基因主要可以通过质粒、转座子和整合子等进行水平传播，其中整合子水平式传播是介导革兰阴性菌特别是肠道菌和假单胞菌属细菌多重耐药的重要原因。现已确认至少有9种整合子，但是起最主要作用的为第一类整合子［1，2］。第一类整合子主要由两个保守端以及在保守端之间的耐药基因盒组成。5′保守端有编码整合酶的intI1基因及启动子，大

3、多数3′保守端有三个ORF：编码耐季铵盐化合物及溴乙锭的耐药基因(qacE△1)、耐磺胺耐药基因(sulI)和功能不明的ORFu。整合子在整合酶的催化下，通过整合酶在59bp的特定识别位点，将游离的耐药基因盒整合到自身。耐药基因盒中的耐药基因不能自身表达，当它整合到整合子后，在整合子5′保守区域的启动子的作用下得到表达，使细菌显示出耐药性。一些数据表明细菌整合子可以携带多个耐药基因盒，同时对多种抗生素产生抗性。因此研究整合子介导的细菌耐药机制，对研究细菌的多重耐药有非常重要的意义。本文对5株临床

4、分离的第一类整合子阳性铜绿假单胞菌的耐药基因盒进行检测，分析其耐药基因，并对其相关的同源性进行比较。进一步讨论条件致病菌在院内的传播以及整合子在细菌耐药中的介导作用。1材料和方法1.1实验用菌株实验所用的5株铜绿假单胞菌均分离自2006年暨南大学附属第一医院患者样本。第一类整合子阳性对照菌株为V.choleraeO1SK10，由丹麦皇家畜牧兽医和农业大学兽医微生物学研究室AnitaForslund博士惠赠；第一类整合子阴性对照菌株为E.coliC600由日本大阪府立大学国际防疫学研究室山崎伸二教授惠

5、赠。1.2细菌培养鉴定及药敏试验法国BioMerieux公司全自动微生物分析仪(Vitek32型)鉴定，药敏试验采用纸片扩散法，药敏纸片及MH培养基由英国Oxiod公司生产，根据推荐方案选用药敏纸片。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922、金葡菌ATCC25923和铜绿假单胞菌ATCC27853。抗生素纸片有阿米卡星(AMK)、氨曲南(AZ)、头孢他啶(CAZ)、头孢哌酮(CPZ)、氯霉素(CHL)、环丙沙星(CPLX)、头孢曲松(CRO)、头孢噻肟(CTX)、头孢吡肟(CPE)、庆大霉素(GM

6、)、亚胺培南(IPM)、哌拉西林(PIPC)、复方磺胺甲口恶唑(SMZ/TMP)和妥布霉素(TOB)共14种。药敏方法和结果判断参照CLSI(2006)标准。1.3DNA模板的制备和引物的设计菌株DNA提取参照2.4PFGE结果PFGE结果显示5株铜绿假单胞菌P5、P6、P10、P14和P26的条带完全一致，PFGE结果相同，说明5株PA来自同一克隆。2.5GenBank注册号码所测序的2360bp片断在GenBank的注册号码为AB214531。M:DL2000marker；1：P5；2：P6；3

7、：P10；4：P14；5：P26图1引物inFandinBPCR反应产物电泳图3讨论目前，整合子系统对于研究细菌的耐药性显得尤为重要［6］。来自临床的耐药菌株中，整合子的阳性率在50%以上［2，7，8］。同时，在畜牧业和环境等各方面分离出来的菌株也有整合子介导的耐药菌株存在。在院内感染分离出来的菌株中，由于患者抵抗能力差，致病菌在患者体内存活时间长，因此在多种抗生素的选择压力下容易形成多重耐药菌株。为此，研究院内感染细菌的耐药性十分重要，对于治疗和新型抗生素的研发有一定指导作用。铜绿假单胞菌是院

8、内获得性感染的常见致病菌，耐药率高、耐药机制复杂，并且有逐年增多的趋势。在该5株第一类整合子阳性的铜绿假单胞株中均携带aacA4的耐药基因。aacA4是编码对氨基糖苷类抗生素产生抗性的耐药基因，它在第一类和第三类整合子中均有发现［2］。同时，据报道，编码氨基糖苷类的耐药基因盒为最常见的一类耐药基因盒，目前至少有14种耐氨基糖苷类的基因盒已经被发现［9］。但是，aacA4编码的蛋白并非对所有种类的氨基糖苷类药物均耐药，因为aacA4编码的是氨基糖苷6′N乙酰转移酶［