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1、二至天癸颗粒含药血清对初老小鼠卵巢颗粒细胞分泌功能的影响论文.freelcontainedErzhiTianguiGranuleonthesecretionfunctionofovariangranulosacellsfromprimarysenilemice.MethodsTheserumprimarysenilemiceediumeasuredbychemiluminescenceimmunoassay(CLIA)andSandcontainedErzhiTianguiGranulecouldincreasethesecretionofE2,PandINHB.Concl
2、usionErzhiTianguiGranulecanimprovetheovarianfunctionofprimarysenilemicebyregulatingthesecretionfunctionofgranulosacells.Keycontaineddrug二至天癸颗粒是根据连方主任医师多年的临床研究组方而成,具有补肾益天癸、养血调冲任的作用,.freelanUSA)；酶标仪(MultiskanMK3ThermoLabsystems)。1.2动物初老昆明种小鼠,12月龄,雌性,体重50～70g,山东中医药大学实验动物中心提供。1.3药物二至天癸颗粒,山东中医药
3、大学附属医院制剂室提供(院内批号01FZ032-03)。药物组成：女贞子、墨旱莲、枸杞子、菟丝子、当归、白芍、川芎、熟地黄、制香附、炙甘草等。1.4试剂DMEM/F-12培养基(1∶1)(Hyclone)；青链霉素溶液(Hyclone)；胎牛血清(GIBCO)；L-多聚赖氨酸(SIGMA)；人绝经期促性腺激素(HMG,中国丽珠集团丽宝生物化学制药公司生产)；人绒毛膜促性腺激素(HCG,中国丽珠集团丽宝生物化学制药公司生产)；雌二醇(E2)及孕酮(P)化学发光免疫测定试剂盒(BeckmanAccess公司)；抑制素B(INHB)试剂盒(美国DSL公司)。2实验方法2.1含药血
4、清及正常血清的制备及灭活将初老小鼠25只随机分为5组,分别为初老空白组、二至天癸高、中、低剂量组(分别按成人剂量的18、12、6倍剂量给药)以及六味地黄汤对照组。中药各组每日灌服2次,连续3d。第4日8:00Am灌胃1h后,无菌条件下股动脉取血,对照组小鼠等量生理盐水灌胃,同时取血。将各组血液于4℃下放置4h,3000r/min离心10min,取上清液,经0.22μm滤器抽滤除菌,同组混匀,经56℃、30min灭活分装,-20℃保存备用,同时将取血后的小鼠用颈椎脱臼法处死,解剖,观察各组小鼠双侧卵巢。2.2颗粒细胞收集取12月龄小鼠腹腔注射HMG18U,48h后同时腹腔注射
5、HCG20U,14～16h后脱颈处死,解剖取出输卵管,在体式镜下用TB针划破输卵管壶腹部,收集包括卵子的颗粒细胞团。加入1g/L透明质酸酶消化使颗粒细胞与卵母细胞分离,用孔径为0.074mm筛网过滤,1000r/min离心5min。弃上清,用PBS(-)清洗3次,加入DMEM-F12培养液(含20%胎牛血清、1%青链霉素)重悬。2.3颗粒细胞培养将颗粒细胞悬液按1×106/孔随机种入事先用0.05%L-多聚赖氨酸涂布的24孔培养板内,放入充5%CO2和95%空气的37℃恒温孵箱中预培养24h,倒置显微镜下观察颗粒细胞生长情况。细胞贴壁后换入含10%小鼠血清(各组分别加入正常
6、血清及低、中、高剂量含药血清)、100U/mL青霉素和100mg/mL链霉素的DMEM/F-12培养液,继续培养24h后收集培养液,-20℃冻存,待测E2、P、INHB。2.4培养液中雌激素、孕酮以及抑制素B的测定E2、P采用化学发光免疫法测定,INHB采用双抗夹心酶联免疫吸附法(SandRNA表达量,二至天癸颗粒对其有增强作用,优质卵率与小鼠卵巢IGF-1RmRNA表达量呈正相关；由此推测,二至天癸颗粒提高卵细胞质量可能与增强小鼠卵巢IGF-1RmRNA表达量,提高IGF-1RmRNA的基因转录,引起颗粒细胞和卵细胞内的一系列酶促反应,达到促进卵细胞生长的效果有关4。本实
7、验观察到,二至天癸颗粒高、中剂量组作用最明显,证明其作用有一定的剂量依赖性；其含药血清各剂量组与六味地黄汤组均能有效提高初老小鼠颗粒细胞雌、孕激素以及INHB的分泌量,且高剂量组疗效优于六味地黄汤组。提示二至天癸颗粒提高高龄不孕妇女卵巢反应性的机理可能与其促进颗粒细胞分泌E2、P、INHB有关。【
