外源性vegf诱导的大鼠视网膜血管病变

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1、外源性VEGF诱导的大鼠视网膜血管病变【摘要】目的：探讨外源性VEGF诱导的大鼠视网膜血管病变的特点。方法：大鼠120只随机分为正常对照组、rrVEGF164低、高浓度组。不同时间行荧光素眼底血管造影、视网膜电图振荡电位、组织学检查。结果：高浓度组注射rrVEGF164眼从注射后10d表现为眼底后极部视网膜动脉局限性高荧光，2g/L的rrVEGF1644μL，自身对照眼（左眼）注射等量的0.1mol/LPBS。两眼均为隔天1次，共2次。VEGF高浓度组48只，实验眼每次注射浓度为100mg/L的rrVEGF1644μL，自身对照眼注射等量的0.1mol/LPBS。

2、两眼均为隔天1次，共4次。分别于2，4，6a公司），FITC-Dextran（Sigma公司）。1.2方法大鼠充分散瞳后，30g/L戊巴比妥钠溶液（1mL/kg）ip麻醉。结膜囊表面麻醉，眼科手术显微镜下用30#B-D针头于背侧角膜缘后1mm处刺穿眼球壁后立即出针，角膜缘行前房穿刺，消毒剪刀将自制玻璃体腔微量注射针针尖剪去，暴露开口。10μL加样移液器抽取rrVEGF164或PBS4μL注于消毒的点样纸上。自制玻璃体腔微量注射针立即吸取。沿预先穿刺好的针孔处以45～50°的角度进入眼内并缓慢注射，停留约15s后拔针。术眼涂眼膏，术后3d用3g/L诺氟沙星滴眼液滴眼

3、，2次/d。注射rrVEGF164或PBS前、后，出现玻璃体出血者不纳入实验对象。散瞳后，ip麻醉大鼠，结膜囊表面麻醉。暗适应30min，暗红光下安放3个电极，小号银针柄端连接于电极线末端后，角膜电极插于上方周边部角膜基质层，参考电极置于两眼连线的中点皮下，地电极置于同侧耳根皮下，黑色胶纸遮盖未检查眼。根据国际临床视觉电生理学会制定的视觉电生理标准化方案（1994年），设定刺激参数,双眼分别记录视网膜电图振荡电位(electroretinographicoscillatorypotentials,ERG-OPs)。散瞳后眼底荧光血管造影，鼠尾静脉注射50g/LFI

4、TC-Dextran1.0mL，固定动物，注射造影剂后5s，各个方位眼底照相，每次拍片间隔5～10s，持续3min，选择性拍片直至注射造影剂50min。剥离视网膜，常规电镜制片，每只大鼠每眼随机观察2个铜网，每个铜网随机照相2张。同一组、同一眼别的样本分散，使各组样本容量达24张。对视网膜内核层单个毛细血管管腔面积、血管内皮细胞面积进行形态计量，采用正方测试格计数法测量视网膜内核层单个毛细血管管腔面积、血管内皮细胞的面积。统计学处理：所有数据均用均数±标准差（x±s）表示，采用SPSSforWindoo时玻璃体腔纤维血管样组织增生，眼底观察困难，未行造影检查。2.

5、3组织学观察光镜下低浓度组可见视网膜水肿，各个层次厚度无明显变化。未见突破视网膜内界膜的血管内皮细胞。高浓度组10d时轻度视网膜水肿，2g/L组差异有显著性，单个视网膜毛细血管管腔面积F＝6964.168，P＝0.000。进一步用多个样本均数q检验，4g/L组差异有显著性，F＝313.324，P＝0.000。进一步用多个样本均数q检验，2.3讨论玻璃体腔注射的量过低，玻璃体腔药物浓度、药物在玻璃体内的弥散受影响。Dureau等[2]研究发现注射量为3μL或者5μL具有丢失量少、可重复性等优点。而Hayashi等[3]的经验是：对200～250g的白化病大鼠注射玻璃

6、体的液体量的原则是最大量不超过玻璃体容积的10%。综合考虑，本实验选择大鼠玻璃体腔内注射rrVEGF164的体积为4μL，前房穿刺可防止注射后眼压升高。高分子量右旋糖苷（2×106）标记的荧光素不会从血管内漏出，背景荧光很低[4]。为了比较清晰的显示视网膜血管病变，不遗漏可能出现的早期新生血管，我们选择50g/LFITC-dextran1mL鼠尾静脉注射眼底血管造影，大鼠视网膜血管系统显示清晰。正常大鼠眼底荧光血管造影与人眼比较，具有灌注时间短、荧光素完全消退时间延长等特点。我们推测可能与大鼠体表面积少、高分子量的右旋糖苷标记物使荧光素衰减慢有关。研究糖尿病视网膜

7、病变时最常用的指标是振荡电位各子波波幅的总和（OPsum）[5]。实验中我们诱导的早期视网膜血管病变在一定程度上类似于糖尿病性视网膜病变的早期改变,但未发现明显的视网膜缺血无灌注区域。可能有如下原因：VEGF的浓度和刺激时间不足；极周边部视网膜即使出现上述病变，造影时的角度、动物麻醉时的眼位固定状态也可能影响造影时观察，难以发现。实验结果显示高浓度组2等[6]将VEGF缓释装置置入兔的玻璃体腔，诱导的视网膜病变与增殖性糖尿病视网膜病变类似。Tolentino等[7]认为VEGF诱导的猕猴视网膜出血、水肿、静脉串珠、毛细血管闭塞、微血管瘤、视网膜内血管组织增生等视网

8、膜病变类似