rgs4在huevcs凋亡中的作用及地塞米松对其的影响论文

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1、RGS4在HUEVCs凋亡中的作用及地塞米松对其的影响论文陈星云，赵艳，李平，熊仁，刘苹，杨楠，周元国【摘要】目的研究RGS4对常氧和低氧培养条件下HUEVC细胞凋亡的影响及地塞米松在其中的作用，以探讨RGS4在HUEVC细胞凋亡中的作用及地塞米松处理对其的影响。方法采用O2/N2/CO2三气培养箱模拟常氧和低氧条件培养HUEVC细胞.freeloxiaorhypoxiaandtheeffectofdexamethasoneonit.MethodsHUEVCsulatednormoxiaorhypoxiaofO2/N2/CO2cellincub

2、atorandeter(Annexin-V-FITC-PI)entofdexamethasonehadnoobviouseffectontheapoptosisinnormoxiaethasoneandetimeshothattreatedoxiabutitcaninhibittheapoptosisofHUEVCsinhypoxia;theeffectofdexamethasoneontheapoptosisofHUEVCsisprobablyrelatedtoRGS4,.freelethasoneemploythesamecellsigna

3、lingpathethasoneRGS4急性肺损伤是肺脏炎症和肺微血管通透性增加的急性、进行性呼吸衰竭，其最终阶段即急性呼吸窘迫综合征。血管内皮细胞是连续性衬在血管腔内面，参与体内许多生理和病理生理过程，如维持血管完整性、分泌和释放活性物质、维持血管张力等。在急性肺损伤过程中，肺微血管的变化尤为引人注目，内皮细胞受损被认为是急性肺损伤发生、发展的病理基础。国内外多项研究表明［1～4］，急性肺损伤时内皮细胞发生凋亡，从而导致肺血管内皮－上皮屏障受到破坏，导致血管通透性增加，引起肺水肿和气体交换障碍，地塞米松可以抑制血管内皮细胞的凋亡［6，7］，减

4、轻肺损伤。本研究拟采用HUEVC内皮细胞株，采用常氧和低氧培养，观察RGS4表达质粒转染后皮细胞凋亡和地塞米松处理后内皮细胞凋亡的变化，以阐明RGS4在内皮细胞凋亡中的作用以及地塞米松处理对其的影响。1资料与方法1.1主要试剂质粒：RGS4inpcDNA3.1(+)(RGS0400000，GUTHRIEcDNAResourceCenter，美国)，pcDNA3.1(+)，质粒大量抽提试剂盒(E.Z.N.A.PlasmidMaxiprepKit，Omega)，LifofectaminPlusTMReagent(Invitrogen，美国)。1.2

5、实验分组及指标检测时相点（1）常氧实验分组：1)空白对照组：(controlN1)；2)pcDNA3.1(+)组：(转染pcDNA3.1(+)空质粒，cotrolN2)；3)RGS4转染组：(转染RGS4表达质粒，RGS4N)；4)RGS4转染＋地塞米松处理组(RGS4＋DEXN)；（2）低氧实验分组(1％O2／5％CO2／94N2％)：1)空白对照组：(controlH1)；2)pcDNA3.1(+)组：(转染pcDNA3.1(+)空质粒，cotrolH2)；3)RGS4转染组：(转染RGS4表达质粒，RGS4H)；4)RGS4转染＋地塞米松

6、处理组(10－7M)(RGS4＋DEXH)（3）检测时相点：流式细胞仪检测细胞凋亡分别于低氧处理后6小时、24小时和48小时测定。1.3RGS4以及pcDNA3.1(+)质粒的扩增与提取常规方法扩增RGS4与pcDNA3.1(+)质粒并采用质粒提取试剂盒提取质粒以用于转染1.4HUEVC细胞的培养取液氮中冻存的HUEVC细胞株，迅速放入40℃水浴中，快速溶解细胞。超净工作台内将细胞悬液移入离涯管中，滴加DMEM培养基至8毫升，洗涤细胞。2000转、离心5分钟、弃上清，用DEME再次洗涤沉淀。沉淀用DEME培养基＋小牛血清悬浮+3%内皮细胞生长因

7、子，移入到细胞培养瓶中培养备用。1.5质粒转染(Lipofectamineplus法)细胞接种，6孔板常规接种2×105细胞/每孔；待细胞贴壁，长至培养板的60%～70％开始转染；质粒转染按Lipofectamineplus说明书进行。转染24小时后加入G418筛选(1000μg/ml)，直至筛选出可稳定表达的阳性细胞克隆。1.6流式细胞仪检测细胞凋亡1.6.1在细胞培养瓶内培养未转染细胞和质粒转染后筛选出的阳性细胞克隆。待长满后加入0.25%胰酶500μl，消化9分钟后抽出胰酶，加入1ml培养基终止消化，吹打细胞使之脱壁，然后用培养基稀释到5

8、×105，接种到6孔培养板上培养(质粒转染组维持G418浓度为500μg/ml)。待长满70％左右时，地塞米松组分别加入10－7M的DEX，其余组不加