非小细胞肺癌中ptb对肿瘤抑制基因ceacam1选择性拼接的调控研究论文

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1、非小细胞肺癌中PTB对肿瘤抑制基因ceacam1选择性拼接的调控研究论文摘要目的：研究在非小细胞肺癌及癌旁组织中ceacam1通过选择性拼接而产生的两种转录产物的调控机制。方法:将用PCR方法获得ceacam1基因中从内含子5至外显子8长1606bpDNA片段插入到真核表达载体pCMV中，构建成ceacam1迷你基因模型并与ptb基因共转染，用PCR法鉴定转染后的产物变化；根据外显子7序列设计的探针GAE（16nt）及ACE（8nt）进行凝胶阻滞分析实验。分离与探针结合的蛋白并进行质谱分析。结果:ptb3种cDNA与ceacam

2、1迷你基因共转染后，CEACAMlL表达水平下降，其中ptb4对迷你基因的表达产物影响最大。仅转染迷你基因的细胞中ceacam1L在两条带中所占比例为76.7%，而与ptb3种重组质粒共转染后，比例分别下降至58.3%、64.8%和54.0%。凝胶阻滞实验表明，探针GAE能与核蛋白结合.freel1低表达有明显的相关性，拼接因子PTB参与ceacam1的选择性拼接。关键词迷你基因；选择性拼接；癌胚抗原相关的细胞粘附分子1；拼接因子PTB；凝胶阻滞分析；非小细胞肺癌癌胚抗原相关的细胞粘附分子1(CEACAM1或CCAM1)，在多种

3、上皮细胞起源的肿瘤中起肿瘤抑制基因作用，属于免疫超家族基因1。该基因长约1.48kb，共有9个外显子组成，其中第七外显子长53bp，位于CEACAM1的胞内端，可通过选择性拼接去除，从而产生CEACAM1L和CEACAM1S两种转录产物。CEACAM1L含外显子7，因此胞内端较长，而在CEACAM1S的形成中，由于外显子7被剪切，其胞内端少了73个氨基酸2。有研究表明，CEACAM1在多种肿瘤如肠癌、肝癌、乳腺癌和前列腺癌中的表达水平普遍下降34。当鼠的CEACAM1L被转入鼠的肠癌或乳腺等细胞时，细胞的生长速度明显减慢，恶性程

4、度降低57。Estrera等8研究认为，仅表达CEACAM1L的胞内部分即能产生抑制肿瘤生长的作用，因此CEACAM1L的胞内端对抑制肿瘤的生长是必需的。在肺癌中，RNA原位杂交和Northernblot分析结果表明，CEACAM1L在75%的肺癌旁组织高表达，而CEACAM1S在84%的肺癌组织中高表达9。根据此现象，我们推测CEACAM1第7外显子的选择性拼接与某种拼接因子有关，CEACAM1两种拼接产物的表达谱受到该因子的调控。为了验证此假设，我们采用了迷你基因模型及凝胶迁移等实验表明了ceacam1的第7外显子序列能与拼

5、接因子PTB(polypyrimidinetractbindingprotein，hnRNPⅠ)特异结合，CEACAM1L和CEACAM1S的表达比例与拼接因子PTB的表达水平相关。1材料和方法1.1菌株、质粒及试剂大肠杆菌DH5α由作者所在实验室保存。限制性内切酶、T4DNA连接酶购自TaKaRa公司，pleteTMproteaseinhibitorcocktail购自Roche公司，BCA蛋白定量试剂盒购自Pierce公司，LipofectAMIM和RNAzol试剂购自Invitrogen公司,NonidetP40(NP40

6、)购自Sigma公司。1．2方法1.2.1细胞培养人非小细胞肺癌H157、H1944细胞株由美国M.D.安得森癌症中心毛力先生惠赠。细胞在37℃、5%CO2、DMEM/F12培养基（含5%的小牛血清、100Uml-1青霉素和100μgml-1链霉素）中生长。1.2.2ceacam1迷你基因及ptbpCDNA重组质粒的构建从H157细胞株提取RNA，以随机引物为模板逆转录成cDNA，用RTPCR方法获得ceacam1基因中从内含子5至外显子8长1606bpDNA片段，经酶切后插入到真核表达载体pCMV中，重组质粒经测序鉴定。引物序

7、列为：5′GGGGTACCATGACAAATAATGCTCTACC3′和5′AAAAGCTTGTTAGGTGGGTCATTGG3′。为了避免内含子5和外显子6的连接处拼接位点对拼接可能的影响，我们将内含子5拼接位点内的“ag”突变为“aa”。PTB1、PTB2和PTB43种pCDNAPTB表达载体由冷泉港实验室DavidHelfman惠赠。1.2.3ceacam1迷你基因与ptbpCDNA共转染选用H1944细胞株作为ceacam1迷你基因及ptbpCDNA共转染的宿主细胞，实验按LipofectAMIM转染试剂盒操作说明书进行

8、。细胞在100mm培养皿中长至约80%，加入DNA/lipofectAMIM混合物10μg（40μl）-1，室温放置40min和4ml无血清、无抗生素的培养基混合物，37℃培养6h后，更换为含有血清和抗生素的培养基。转染72h后收集细胞，用RNAzol提取总RN