肺癌中肿瘤抑制基因ceacam1的选择性拼接与p

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1、肺癌中肿瘤抑制基因CEACAM1的选择性拼接与P【关键词】肺癌AlternatingSplicingofTumorSuppressorGeneCEACAM1isCorrelatedail:yldseu.edu.Abstract：ObjectiveThepossibilityofmodulatingthedifferenceofCEACAM1splicingpatternbetortissuesandtheircorrespondingnonmalignantlungtissue.MethodsDetecttheexpressionpatternofCEACAM1

2、innonsmallcelllungcancer(NSCLC)byHotPCR,minigeneconstructsandcotransfectionthisminigenecouldbesplicedinacellspecificmanner.Theexon7inantlyincludedinH1944,butpredominantlyexcludedin22B.OverexpressionofPTBcouldubiquitouslyaltertheratioofCEACAM1LandCEACAM1S.TheamountofCEACAM1Lanne

3、r.Conclusion1exon7.Aclearcorrelationerase购自Qiagen公司。1.2方法1.2.1细胞培养H1944、22B由美国M.D.安得森癌症中心毛力先生惠赠。细胞在37°C、5%CO2、DMEM/F12培养基（5%的小牛血清，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素）中生长。1.2.2RT“Hot”PCRRT“Hot”PCR用末端标记32P的引物进行，上游引物：5’GGTTGCTCTGATAGCAGTAG3’，下游引物：5’AGCCTGGAGATGCCTATTAG3’，来扩增细胞中CEACAM1两种表达产物，分

4、别为CEACAM1L（408bp）和CEACAM1S(355bp)。PCR反应体系为12.5μl，含7%DMSO，1.5mMdNTP，6.7mMMgCl2，16.6mM(NH4)2SO4，67mMTris,10mMβ巯基乙醇，6.7mMEDTA，1.2mM引物，0.625U的Hotstar聚合酶。反应条件如下：95℃变性30s，60℃退火1min，70℃延伸1min，25个循环，PCR产物行6%聚丙烯凝胶电泳，压X光片。1.2.3an惠赠。按文献［9］提取临床标本的核蛋白，1X上样缓冲液（SDSloadingbuffer）溶解，煮沸5min处理后，行SDSPA

5、GE。100V、1.5h将蛋白转至PVDF膜上，在含有20%Tl，带有HRP标记的羊抗兔的二抗室温孵育1小时，TBST清洗8次，每次5ml，加入发光底物，X光片感光显色观察。1.2.4CEACAM1迷你基因重组质粒的构建用PCR方法获得CEACAM1基因中从内含子5至外显子8长1606bpDNA片段插入到真核表达载体pCMV中，重组质粒经测序鉴定。引物序列为：5’GGGAATTCCCATGACAaATAATGCTCTACC3’和5’GGTACCCTTGTTAGGTGGGTCATTGG3’。为了避免内含子5和外显子6的连接处拼接位点核苷酸序列可能的影响，我

6、们将内含子5拼接位点内的“ag”突变为“aa”。1.2.5迷你基因与PTB共转染我们选用主要表达CEACAM1L的H1944细图1CEACAM1LandCEACAM1S在NSCLC细胞株中的表达图4H1944细胞株中与PTB共转染后迷你基因L/S表达谱图2肺癌组织中PTB的m培养皿中长至约80%，加入DNA/lipofectAMIM混合物(10μg/40μl，室温放置40min)和4ml无血清、无抗生素的培养基混合物加入细胞中，37℃培养6h后，更换为含有血清、抗生素的培养基。转染72h后收集细胞，用RNAzol提取总RNA，每种载体重复转染3次。用位于外显子6

7、中的序列作为引物S1：5'GGTTGCTCTGATAGCAGTAG3'和载体上的T7序列为引物：5’TAATACGACTCACTATAGGGAG3’，来扩增转染的CEACAM1迷你基因的表达产物。PCR反应条件如下：94℃变性1min，55℃退火1min，72°C延伸2min，25个循环，PCR产物经测序鉴定。2结果2.1RT“Hot”PCRRT“Hot”PCR结果见图1，CEACAM1两种产物的表达有细胞特异性，在H1944及A549细胞株中，主要以CEACAM1L的形式存在，而在大部分其他细胞株中，则主要以CEACAM1S的形式存在。2.2PT

8、B的1L低