甘露消毒丹对温病湿热证大鼠tlr4mrna、nfκbp65表达的影响论文

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1、甘露消毒丹对温病湿热证大鼠TLR4mRNA、NFκBp65表达的影响论文【摘要】观察甘露消毒丹对温病湿热证大鼠细胞内毒素Toll样受体4（TCR4)mRNA及核因子κB（NFκB)p65表达变化的影响，探讨清热化湿方的治疗机制。【方法】将arker（美国Promoga公司）；TaqDNA聚合酶、DNTP（美国MBI公司）；免抗鼠多克隆NFκB(美国chemTcoa公司）；PCR引物由上海生工公司合成；PCR仪（BiometreUNOⅡ,.freelRNA的检测采用逆转录-聚合酶链反应技术（PTPCR）。1.4.1肝组织总RNA的提取及鉴定按Trizol

2、Reagent操作指南提取细胞总RNA。1.4.2逆转录反应按SuperscriptTMPreamplicationSystem操作指南进行。1.4.3PCR反应取2μLRT产物进行PCR反应。PCRR反应条件：95℃孵育5min，95℃变性45s，57℃（扩增不同片段采用合适的不同温度）复性50s，72℃延伸50s。末次循环72℃延伸10min。查基因库，设计TLR4mRNA的引物序列：上游为5AATGAGGACTGGCTGAC3，下游为5TGAGGTCGTTGAGCTTAG3，PCR扩增产物长度为589bp，退火温度为51℃，32次循环；β

3、actin引物序列：上游为5ACCACAGCTGAGAGCGAAATCG3，下游为5AGAGGTCTTTACGGATCTCAACG3，扩增产物281bp，退火温度为57℃，30次循环。1.4.4PCR产物电脉及结果检测PCR产物经20g/L的琼脂糖凝胶电泳（含0.5μg/mL的溴化乙啶），电泳缓冲液为1倍Tris乙酸（TAE），在50V电压下电泳30min，紫外灯下观察结果，并以数码照码相机照相。GIS凝胶电脉分析系统扫描并分析各组目的基因及βactin基因的灰度值，以二者的比值代表目的基因的表达量。1.5NFκBp65的检测采用免疫组化技

4、术［3,4］。用40g/L多聚甲醛固定72h的各组大鼠肝组织切取2mm×2mm×2mm大小，石腊包埋，取4μm厚的石蜡切片；石蜡切片脱蜡入水后，分别采用微波、高压抗原修复；每张切片加一滴正常山羊血清封闭20min；每张切片滴加一抗（免抗鼠多克隆NFκBp65抗体（1：50）］4℃过夜；0.01mol/LPBS洗涤后滴加生物素偶联的二抗，37℃孵育20min，PBS洗涤5min，反复4次。低价联苯二胺（DAB）室温染色7min后蒸馏水洗涤，苏木素复染，脱水，透明，封片。阳性结果判断：NFκBp65免疫反应阳性细胞为细胞核染成棕黄色或深棕色颗粒沉积。在图像分析仪

5、上，每个切片随机取8个高倍视野，测定一定面积内平均光密度。1.6统计学处理用SPSS13.0统计软件分析。2结果2.1甘露消毒丹对大鼠肝组织巨噬细胞TLR4mRNA表达的影响模型组肝组织TLR4mRNA表达水平显著性升高，而除6h时点外甘露消毒丹组可使TCR4mRNA/A水平显著性降低（均P＜0.05或P＜0.01）。结果见表1图1。2.2甘露消毒丹对大鼠肝组织巨噬细胞NFκBp65表达的影响表2结果表明：模型组肝组织NFκBp65表达水平显著性升高，甘露消毒丹可显著性降低NFκBp65的表达水平（均P＜0.05或P＜0.01）。图2结果显示：肝脏巨噬细胞

6、NFκBp65阳性着色出现胞质和胞核表达，以胞质表达为主，呈棕黄色染色或棕褐，结果：模型组6、12、24小时不同时相由棕黄色染色逐渐呈棕褐，治疗组6、12、24小时不同时相逐渐正常。表1各组大鼠肝组织巨噬细胞TLR4mRNA表达水平比较表2各组大鼠肝组织巨噬细胞中NFκBp65平均光密度结果比较3讨论湿热证的病因是湿热之邪（湿与热之合邪），主要包括湿热外侵与内生两个方面，其病变以脾胃为重心。由于湿热之邪具有蒙上流下、内熏外渍之性，既可阻滞气机，又可伤阳耗阴，随着病情发展，常可形成痰热、瘀血，并兼夹为患。湿热证具有病势缠绵、病变复杂等特点。随着理论探讨、临床观

7、察和实验研究的逐步深入，特别是近10年来免疫学、分子生物学等先进实验技术的应用，对湿热病证的模型、病因病机及治疗等方面进行了一些有益的探索，为湿热证的深入研究奠定了良好的基础。近几年内毒素特异受体及转导信号的发现，为湿热病证的深入研究提供了契机。1.Marker；2.24h治疗组；3.12h治疗组；4.6h治疗组；5.24h模型组；7.6h模型组；8.对照组（整个过程同湿热模型组，不灌服大肠杆菌）；9.正常组Figure2DectectionofNFκBp65inhepaticmacrophagebyimmunohistochemicalmethed脂多糖（l

8、ipopolysacch