甘露消毒丹对温病湿热证大鼠tlr4mrna、nfκbp65表达的影响

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1、甘露消毒丹对温病湿热证大鼠TLR4mRNA、NFκBp65表达的影响【摘要】观察甘露消毒丹对温病湿热证大鼠细胞内毒素Toll样受体4（TCR4)mRNA及核因子κB（NFκB)p65表达变化的影响，探讨清热化湿方的治疗机制。【方法】将arker（美国Promoga公司）；TaqDNA聚合酶、DNTP（美国MBI公司）；免抗鼠多克隆NFκB(美国chemTcoa公司）；PCR引物由上海生工公司合成；PCR仪（BiometreUNOⅡ,美国）；紫外可见分光光度计（U2000,HitochiJapan);核酸电泳仪（北京东方仪器厂）；H

2、MIAs2000彩色医学图文分析系统（湖北干屏影像公司）；人工气候箱（SHH500GS型，重庆市永生实验仪器厂）。1.3分组与造模［1-2］大鼠驯养3d后随机分为3组，各24只，分别为正常组：在正常温、温度环境下，普通饲料喂养29d。湿热模型组：在正常温、湿温度环境下，高脂饲料喂养2周后，每天择时放入人工气候箱中（温度35℃，相对湿度95%），时间为上8～12时，下午13～17时，纯度高脂饲料喂养；12d后灌胃大肠杆菌5×109/kg（预实验模索剂量），4h后，再加强灌服1次，继续放入人工气候箱观察1d。治疗组：整个过程同湿热模型组，灌

3、服大肠杆菌前1天预服中药1次，造模后第1天灌胃3天，剂量为10g/kg，分别于感染6、12、24h时，处死各组大鼠取肝组织。1.4TLR4mRNA的检测采用逆转录-聚合酶链反应技术（PTPCR）。1.4.1肝组织总RNA的提取及鉴定按TrizolReagent操作指南提取细胞总RNA。1.4.2逆转录反应按SuperscriptTMPreamplicationSystem操作指南进行。1.4.3PCR反应取2μLRT产物进行PCR反应。PCRR反应条件：95℃孵育5min，95℃变性45s，57℃（扩增不同片段采用合适的不同温度）复性50

4、s，72℃延伸50s。末次循环72℃延伸10min。查基因库，设计TLR4mRNA的引物序列：上游为5AATGAGGACTGGCTGAC3，下游为5TGAGGTCGTTGAGCTTAG3，PCR扩增产物长度为589bp，退火温度为51℃，32次循环；βactin引物序列：上游为5ACCACAGCTGAGAGCGAAATCG3，下游为5AGAGGTCTTTACGGATCTCAACG3，扩增产物281bp，退火温度为57℃，30次循环。1.4.4PCR产物电脉及结果检测PCR产物经20g/L的琼脂糖凝胶电泳（含

5、0.5μg/mL的溴化乙啶），电泳缓冲液为1倍Tris乙酸（TAE），在50V电压下电泳30min，紫外灯下观察结果，并以数码照码相机照相。GIS凝胶电脉分析系统扫描并分析各组目的基因及βactin基因的灰度值，以二者的比值代表目的基因的表达量。1.5NFκBp65的检测采用免疫组化技术［3,4］。用40g/L多聚甲醛固定72h的各组大鼠肝组织切取2mm×2mm×2mm大小，石腊包埋，取4μm厚的石蜡切片；石蜡切片脱蜡入水后，分别采用微波、高压抗原修复；每张切片加一滴正常山羊血清封闭20min；每张切片滴加一抗（免抗鼠多克隆NFκB

6、p65抗体（1：50）］4℃过夜；0.01mol/LPBS洗涤后滴加生物素偶联的二抗，37℃孵育20min，PBS洗涤5min，反复4次。低价联苯二胺（DAB）室温染色7min后蒸馏水洗涤，苏木素复染，脱水，透明，封片。阳性结果判断：NFκBp65免疫反应阳性细胞为细胞核染成棕黄色或深棕色颗粒沉积。在图像分析仪上，每个切片随机取8个高倍视野，测定一定面积内平均光密度。1.6统计学处理用SPSS13.0统计软件分析。2结果2.1甘露消毒丹对大鼠肝组织巨噬细胞TLR4mRNA表达的影响模型组肝组织TLR4mRNA表达水平显著性升高，而除6h时

7、点外甘露消毒丹组可使TCR4mRNA/A水平显著性降低（均P＜0.05或P＜0.01）。结果见表1图1。2.2甘露消毒丹对大鼠肝组织巨噬细胞NFκBp65表达的影响表2结果表明：模型组肝组织NFκBp65表达水平显著性升高，甘露消毒丹可显著性降低NFκBp65的表达水平（均P＜0.05或P＜0.01）。图2结果显示：肝脏巨噬细胞NFκBp65阳性着色出现胞质和胞核表达，以胞质表达为主，呈棕黄色染色或棕褐，结果：模型组6、12、24小时不同时相由棕黄色染色逐渐呈棕褐，治疗组6、12、24小时不同时相逐渐正常。表1各组大鼠肝组织巨噬细胞

8、TLR4mRNA表达水平比较表2各组大鼠肝组织巨噬细胞中NFκBp65平均光密度结果比较3讨论湿热证的病因是湿热之邪（湿与热之合邪），主要包括湿热外侵与内生两个方面，其病变以脾