大鼠传代培养肝细胞的形态学观察论文

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1、大鼠传代培养肝细胞的形态学观察论文.freelo龄SD雄性大鼠肝脏，制备肝细胞悬液并进行原代及传代培养，对其形态学进行了观察.结果肝细胞已传7代，每次传代培养6d左右，光镜下可见大量新生肝细胞生长，呈多边形.freelicroscopy，elec-tron;ratsAbstract:AIMTosubculturerathepatocytesandtoob-servetheirmorphologicalcharacteristics.METHODSHepa-tocytes1-month-oldratsbytaryculture-sofhepatocytesorphologicalc

2、haracteristicsicroscope，andagreatnumberofneoformativepolygonhepatocytesedeformedunderTEM.Someofthemdecreased.CONCLUSIONSubculturerathepatocytesprovideaconve-nientmethodforthestudyofhepatocytes.0引言在研究体外肝脏多种多样的功能中，需要建立一个简单的系统来精确地模仿体内肝脏的活动.1969年Berry和Friend用胶原酶灌注分离细胞，使细胞产量大幅度提高，这些细胞具有许多肝脏功能.我们在肝

3、细胞原代培养的基础上，又成功地进行了肝细胞的传代培养，以利于肝细胞的研究.1材料和方法1.1材料上海产1mo龄SD雄性大鼠，体质量90～100g.DMEM培养基（Gibco公司），0.3gL-1Ⅰ型胶原酶溶液5.0mL（Sigma公司，DMEM为溶剂），磷酸缓冲液（PBS）250mL，RDB-TB蠕动泵（江苏省张家港市仪表仪器总厂），离心机，型号为Biofuge15R（德国Heraeus公司）.1.2方法SD雄性大鼠腹部消毒后按2mLkg-1，ip，10gL-1戊巴比妥钠麻醉，仰卧位固定.脱去胸腹部毛，消毒，无菌操作下，开胸将导管插入下腔静脉胸段，丝线固定.开腹显露门静脉，远离肝

4、脏处结扎肝动脉、脾静脉、下腔静脉与肾静脉汇合处，剪破门静脉近肝脏处，以9mLmin-1速度灌注PBS15min，以8mLmin-1速度灌注Ⅰ型胶原酶溶液10min，收集细胞于DMEM中，依次经100，150，180，280，400目不锈钢滤网过滤后的细胞悬液于4℃，50g离心2min，弃上清，反复离心3次，沉积的细胞用含100mLL-1小牛血清DMEM调整细胞密度为2×108L-1，台盼蓝拒染法测细胞活力0.90，以此细胞密度在6孔培养板中加入细胞4×105/孔.36h后首次换液，以后每48h换液1次.肝细胞培养20d时，于位相差倒置显微镜下可见细胞融合成片.传代前用无血清培养基

5、培养1d，弃去培养液，加入1.25mLL-1胰蛋白酶（1mL/孔）于37℃作用6min，镜下见胞质回缩，细胞间隙增大.此时吸去胰蛋白酶加入含100mLL-1小牛血清DMEM，吸管轻轻反复吹打培养皿底部，调整细胞密度为2×108L-1.台盼蓝拒染法测细胞活力为0.98，重新接种于新的培养皿进行传代.在位相差显微镜下观察培养6d的各代肝细胞形态并拍照.经首次传代培养6d的肝细胞，吸出培养液，加入1.25mLL-1胰蛋白酶于37℃下作用8min，吸去胰蛋白酶，加入含100mLL-1小牛血清DMEM，吸管轻轻吹打培养皿底部，细胞悬液收集于锥形离心管中，以2000rmin-1速度离心10m

6、in，沉积物加入戊二醛固定，常规包埋，切片，染色，于透射电镜下观察并摄像.细胞计数与活力检测:细胞培养过程中用台盼兰拒染法检测培养细胞活力，用血球技术板计算细胞数.2结果肝细胞传代培养6d，可见新生肝细胞大量生长，呈多边形，相嵌紧密排列.细胞培养过程中未见成纤维细胞生长，亦无细菌及真菌污染.培养中抽查细胞活力为0.98，现已传7代（Fig1）.传一代肝细胞在电镜下可见核变形，有的为双核，细胞膜上有大量微绒毛（Fig2）.胞质内有丰富的细胞器，如大量的内质网和线粒体，其中有典型的车轮状线粒体，大量玫瑰花瓣型糖原颗粒，还有溶酶体等细胞器（Fig3）.图1略3讨论在研究体外肝脏多种多样

7、的功能中，需要建立一个简单的系统来精确地模仿体内肝脏的活动.细胞培养技术便是最常用的方法［1-4］.我们先前已经建立了长期培养的细胞系［5］，而肝细胞的传代培养，更有利于肝细胞的研究.肝细胞培养数周后，肝细胞就被一种含有透明细胞质的小细胞替代.这种细胞具有上皮样改变，且可传代.虽然这种细胞与原来的肝细胞形态略有不同，却具有典型肝细胞的多项功能特征.他们具有较高水平的γ-谷氨酰转肽酶，可合成Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ型胶原，具有胰岛素和EGF受体，其水平分离的肝细胞水平相似，可以合成和分泌多种血清