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1、原阿片碱和别隐品碱对DNA拓扑异构酶I的抑制活性论文刘朝亮，程轩轩，王冬梅，杨得坡【摘要】目的研究原阿片碱（protopine）和别隐品碱（allocryptopine）对DNA拓扑异构酶I（TOPOI）活性的影响。方法以pBluescript-II-KS(+)DNA为底物，采用琼脂糖凝胶电泳检测protopine和allocryptopine对TOPOI介导的pBluescriptDNA解旋反应的影响。结果在同等浓度下（100μmol/L），protopine和allocryptopine具有显著的TOPOI抑制作用，且抑制浓度与阳性对照药喜树碱相当。结论对TOPO
2、I活性的抑制可能是protopine和allocryptopine体外抗肿瘤作用机制之一。【关键词】原阿片碱；别隐品碱；抗肿瘤；拓扑异构酶I原阿片碱（protopine）和别隐品碱（allocryptopine）为异喹啉类生物碱。据报道，二者均有抗心律失常［1.freelptothecin,CPT）购自美国Sigma公司。Protopine和allocryptopine为实验室自制，HPLC检测纯度95%。琼脂糖凝胶、β-巯基乙醇、溴乙锭（EB）、溴酚蓝、硼酸、甘油、苯酚、十二烷基硫酸钠（SDS）、二甲基亚砜（DMSO）、EDTA（ethylenediamineN,N
3、,N',N'-tetraacetate）、牛血清白蛋白（bovineserumalbumin,BSA）、NaOAc、KCl、MgCl2均购自美国Sigma公司；Tris（Ultrapure）购自美国USB公司。pBluescript-II-KS(+)DNA（Stratagene,LaJolla,CA,USA）；DNA拓扑异构酶I（HumantopoisomeraseI,Sigma,USA）；蛋白酶钾（ProteinaseK,RocheAppliedScience,Mannheim,.freelany）。1.2仪器中型水平电泳槽（MGU-502T，美国CBS）；Koda
4、k凝胶成像系统（EDAS290，120，USA）。2方法在4μl5×反应缓冲液（35mmol/LTris-HClpH7.5,50mmol/LKCl,5mmol/LMgCl2,3mmol/Lβ-巯基乙醇,0.1mmol/LEDTA,2mmol/Lspermidine,50μg/mlBSA）中加入0.5μgpBluescriptDNA、2UTOPOI（1UTOPOI在pH7.5，37℃条件下，15min内可以使0.25μg的超螺旋质粒DNA完全解旋）及不同的受试药物，包括阳性对照药CPT和自制的生物碱（药物均溶解于少量DMSO中，终浓度为100μmol/L），并加三蒸水至
5、20μl，置37℃反应30min。加2μl10%SDS和1μl蛋白酶K（10mg/ml）终止反应，继续孵育1h。最后加2μl上样缓冲液（30%甘油、0.25%溴酚蓝），0.9%琼脂糖（含0.5μg/mlEB）电泳，0.5×TBE缓冲液，80V电压，电泳2h，凝胶成像系统观察电泳条带并拍照。3结果Protopine和allocryptopine对TOPOI酶活性的影响见图1。由图可知，生物碱allocryptopine、protopine具有显著的TOPOI抑制作用，且抑制强度与阳性对照药喜树碱相当。TOPOI抑制剂的药理机制主要是：它稳定了“药物-拓扑酶-DNA”三元
6、复合物，妨碍了TOPOI介导的单链DNA切口的再连接。就是在药物作用下，TOPOI切开DNA单链，酶蛋白与末端DNA以共价键形成一种具破坏性的易解离的三元复合物，具有中毒效应的抑制剂使易解离复合物稳定和僵化，形成“路障”，使复制不能进行下去，从而导致DNA断裂和细胞死亡。一般来说，TOPOI抑制剂有两种作用机理［5,6］：①特异性抑制：药物直接结合于拓扑酶-DNA复合物上，即药物几乎只与复合物作用且使复合物稳定存在，喜树碱就是该种作用机制。②非特异性抑制：药物直接与DNA嵌合，阻止拓扑酶作用于DNA，同样使复制无法进行下去。这两种作用方式可以通过电泳图谱中的缺口环状D
7、NA带（Nickband）和超螺旋DNA带（Supercoiledband）的形成状态加以区分。本实验通过分析琼脂糖凝胶电泳图谱，评价受试药物稳定三元复合物的能力。图1所示，可以反映出药物对TOPOI的影响，从上至下依次是缺口环状DNA带（Nickband）、线状双链DNA带（Relaxedband）和超螺旋DNA带（Supercoiledband）。从图谱上的条带来看，protopine和allocryptopine与阳性对照药喜树碱的作用机制相同——“特异性抑制”，即药物直接结合于拓扑酶-DNA复合物上。4讨论DNA拓扑异构酶作为重要的细胞核内酶
