脑益康对阿尔茨海默病模型大鼠脑组织内β淀粉样蛋白及其产生通路的影响

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1、脑益康对阿尔茨海默病模型大鼠脑组织内β淀粉样蛋白及其产生通路的影响作者：缪丽莉周爱玲朱燕施海燕【摘要】目的通过建立阿尔茨海默病（AlzhEimer'sdisease,AD）大鼠模型,观察脑益康对AD大鼠学习记忆能力、β淀粉样前体蛋白（β-amyloidprecursorprotEIn,β-APP）裂解途径的影响，探讨脑益康改善AD模型大鼠症状的机制。方法采用β淀粉样蛋白毒性片段－(β-amyloidprotein25－35，Aβ25－35)海马注射建立AD大鼠模型,用电迷宫刺激器检测大鼠学习记忆能力；免疫组织化学方法观察大鼠脑组织Aβ40/42表达的变化；逆转录－聚合酶链式

2、反应（reversetranscriptionpolymerasechainreaction,RT-PCR）方法检测大鼠海马β-APPmRNA表达情况；ICON公司)；BACE1抗体(北京博奥森生物技术有限公司)；山羊抗兔IgG免疫组化试剂盒（北京中衫生物工程有限公司，批号：SP9001）；引物（上海捷瑞生物工程有限公司）；BCA蛋白浓度测定试剂盒﹑免疫印迹化学发光试剂（BeyoECLPlus）（均购自海门碧云天生物技术研究所）。　　1.3仪器大鼠脑立体定位仪（美国Stoelting公司）；Y-型（MG-B型）迷宫刺激器（张家港市三兴教学机械厂）；冰冻切片机（LAICACM

3、1900，德国）；PTC-100PCR仪（美国Bio-rad公司）；Miniprotein-3电泳装置（美国Bio-rad公司）；Trans-blot转印槽（美国Bio-rad公司）。　　2方法　　2.1分组、造模与给药用电迷宫刺激器筛选出学习记忆能力正常的SD大鼠48只，随机分为6组：假手术组，模型对照组及阳性药脑复康（0.4g·kg-1·d-1）对照组，脑益康小、中、大剂量组（1.73，3.45，6.90g·kg-1·d-1）。其中，脑益康中剂量相当于临床用量，每组8只。将大鼠用10％水合氯醛（4ml·kg-1）腹腔注射麻醉后，固定于脑立体定位仪，颅顶部剪毛，碘酒和酒精

4、消毒后，无菌条件下切开皮肤，分离颅骨外骨膜，显露前囟，记录前囟A（矢状轴）、L（冠状轴）、V（垂直轴）的坐标，参照《大鼠脑立体定位图谱》确定右侧海马CA1区位置，定位坐标：前囟后3.0mm，中线右侧2.0mm，硬膜下4mm，在颅骨定位处钻一小孔，缓慢垂直进针至靶点，然后将5μlAβ25－35(用生理盐水将冻干粉状Aβ25－35稀释成2μg·μl-1,37℃下孵育1周，使其变为聚集态的Aβ25－35）缓慢注入，注射速度为0.5μl·min-1，留针5min，以保证溶液充分弥散，再缓慢撤针，无颅内出血后缝合皮肤。假手术组注射等量生理盐水，余操作同前。所有操作均在无菌条件进行，手

5、术后大鼠分笼饲养。于术后第2天开始灌胃给药，1次/d，给药容量为0.1ml·kg-1，脑复康脑益康均由0.5％羧甲基纤维素钠配制灌胃，假手术组给予生理盐水，模型对照组给予溶剂，连续30d。　　2.2迷宫刺激器实验Y-型迷宫刺激器为三等臂式电迷路箱，三臂（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）间的夹角为120°，臂长48cm，宽16cm，高19cm，各臂末端均装有信号灯。箱底铺设铜栅，供通电刺激用。通过控制器开关，可使三臂交替作为安全区（不通电，灯亮）。于用药30d后测试大鼠的学习、记忆能力。实验固定在上午8：00～12：00进行，保持周围环境安静，避免强光刺激。将大鼠放入迷宫刺激器的一臂，适应环境3

6、min后给予电刺激（60V，持续2s）。其余两臂中的任一臂给予灯光信号，示为安全区。大鼠进入安全区，为正确反应，否则为错误反应。第2次训练以此安全区作为起步区，并使大鼠停留在安全区1min以巩固记忆。再次给予电刺激，以此类推，按方向（Ⅰ→Ⅱ→Ⅲ→Ⅰ）依次改变安全区位置。学习测试：以测试达到连续10次中有9次（9/10）正确反应前所需的电击次数即尝试次数表示学习能力。记忆再现测试：学习测试完成24h后以同样方法进行，以达到9/10标准前的尝试次数表示记忆能力。　　　　2.3取材方法和样品制备将大鼠用20％水合氯醛腹腔麻醉后，剪开胸腔，暴露心脏，从左心室插灌注针至升主动脉，用眼

7、科剪剪开右心耳。先快速灌注生理盐水150ml至流出液清亮，再灌注预冷的4%多聚甲醛500ml（先快后慢于1h内灌注完）。灌注结束后迅速断头取脑，去除小脑和嗅球，4%多聚甲醛中后固定6～8h。将全脑依次移入含20%和30%蔗糖的磷酸盐缓冲液中进行梯度固定，置于4℃冰箱中至组织块沉烧杯底。取实验所需部位于恒冷切片机中在-20℃下冰冻连续切片，片厚30μm。　　2.4免疫组织化学染色按免疫组化SP试剂盒方法进行Aβ40/42免疫组织化学染色，以0.01MPBS代替一抗做阴性对照，Aβ40/42免疫阳性细胞在光镜下胞质和突