抗尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶2单克隆抗体的制备与鉴定

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1、抗尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶2单克隆抗体的制备与鉴定作者：王婉，高媛，杨金菊，柳晓兰，鞠艳芳，刘莉，陈志成刘蓉，迟俊，邢维贤，高建恩，安立国，孙启鸿【摘要】　　本研究制备抗人尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶2（UDPglucosepyrophosphorylase2）的单克隆抗体（mAb）并进行初步鉴定。将正常成人肝组织匀浆离心并分离肝脏胞浆总蛋白，用肝脏胞浆总蛋白免疫BALB/c小鼠，采用杂交瘤技术制备单克隆抗体，通过间接ELISA法、onoclonalAntibodyAgainstAbstractThestudy

2、edtogeneratemonoclonalantibodies(mAbs)againsthomosapiensUDPglucosepyrophosphorylase2(UGP2).Normalhumanlivertissueshomogenized,andcytosolicprotEinsisolatedbycentrifugationmunizeBALB/cmicetogeneratemAbsbyhybridomatechnique.ThemAbsmunohistochemistryassay.Theant

3、ibodyspecificityedbyUniZAPexpressionlibraryscreening.TheresultsindicatedthatonehybridomaBAD062secretingspecificmAbagainstUGP2Abmunohistochemistryassay.TheantigenrecognizedbyBAD062mAb,olecularanlivertissue.TheBAD062mAbedbyimmunoscreeningofUniZAPXRlivercDNAex

4、pressionlibrary.ItisconcludedthatahybridomacelllinestablysecretesspecificmAbagainstUGP2.ThismAbreactedmunohistochemistryassay,andAb;cDNAexpressionlibrary尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶2（UDPglucosepyrophosphorylase2,UGP2）是糖原生物合成过程中的一种酶，由508个氨基酸组成，相对分子质量（Mr）约为56000，催化UTP与葡萄糖1

5、P的反应,生成UDP葡萄糖。UDP葡萄糖是主要活化糖的形式，作为葡萄糖基供体参与蔗糖、纤维素、半纤维素、果胶质以及糖脂、糖蛋白的合成代谢［1］。摄入人体内的葡萄糖可在葡萄糖激酶、葡糖磷酸变位酶和尿苷二磷酸葡糖焦磷酸化酶（UGP2）的催化下形成尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）。此外，UGP2还与腺嘌呤二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）相偶联，形成ADPG，参与淀粉的合成［1,2］。在糖原合成和分解过程中该酶的缺陷即导致临床表现的糖原累积病。UGP2在骨骼肌中高表达，其次在肝脏中也有较高的表达量。我们应用成人肝组

6、织胞浆总蛋白免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体，其中1株为鼠抗人UGP2单克隆抗体，并对其特异性进行了鉴定。这为进一步研究UGP2在糖蛋白代谢中的作用奠定了基础。中国实验血液学杂志JExpHematol2007;15(3)抗尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶2单克隆抗体的制备与鉴定材料和方法材料免疫和筛选用成人肝组织胞浆总蛋白，由本室制备。其它主要试剂和仪器包括：弗氏佐剂（Sigma公司产品），羊抗鼠IgGHRP（中山公司产品），蛋白酶抑制剂（Roche公司产品），BCA蛋白定量试剂盒（Pierce公司产品），PVDF

7、膜（Amersham公司产品），ECL反应试剂盒（Amersham公司产品），DY89Ⅱ型电动玻璃匀浆机（宁波新芝生物科技股份有限公司产品）。成人肝组织胞浆总蛋白抗原的制备取10g正常人肝组织加40ml匀浆缓冲液［3］，以每分钟700-750转速率制成肝组织匀浆，然后10000×g离心10分钟，取上清，即获得成人肝组织胞浆总蛋白；采用BCA法测定蛋白浓度，SDSPAGE鉴定抗原的相对分子质量。鼠抗人mAb的制备将成人肝胞浆总蛋白1mg与等体积弗氏完全佐剂混合后进行充分乳化，给BALB/c小鼠多点皮下注射。首次

8、免疫后4周，再加强免疫1次，1周后经尾静脉取血，分离血清，用ELISA法测定效价。融合前3天进行加强免疫，取小鼠脾细胞与X653细胞进行细胞融合，采用杂交瘤技术制备mAb。mAbs的鉴定Ab，室温下孵育2小时（或4℃过夜），TBST缓冲液洗膜后，加入羊抗鼠IgGHRP抗体（1∶5000稀释），室温下孵育1小时，TBST缓冲液洗膜后，ECL法显色。免疫组织化学鉴定用丙酮