抗尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶2单克隆抗体的制备与鉴定论文

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1、抗尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶2单克隆抗体的制备与鉴定论文王婉，高媛，杨金菊，柳晓兰，鞠艳芳，刘莉，陈志成刘蓉，迟俊.freelAb）并进行初步鉴定。将正常成人肝组织匀浆离心并分离肝脏胞浆总蛋白，用肝脏胞浆总蛋白免疫BALB/c小鼠，采用杂交瘤技术制备单克隆抗体，通过间接ELISA法、onoclonalAntibodyAgainstAbstractThestudyedtogeneratemonoclonalantibodies(mAbs)againsthomosapiensUDPglucosepyrophosphorylase2(UGP2).Normalhumanlivertissuesh

2、omogenized,andcytosolicproteinsisolatedbycentrifugationmunizeBALB/cmicetogeneratemAbsbyhybridomatechnique.ThemAbsmunohistochemistryassay.TheantibodyspecificityedbyUniZAPexpressionlibraryscreening.TheresultsindicatedthatonehybridomaBAD062secretingspecificmAbagainstUGP2Abmunohistochemistryassay.The

3、antigenrecognizedbyBAD062mAb,olecularanlivertissue.TheBAD062mAbedbyimmunoscreeningofUniZAPXRlivercDNAexpressionlibrary.ItisconcludedthatahybridomacelllinestablysecretesspecificmAbagainstUGP2.ThismAbreactedmunohistochemistryassay,andAb;cDNAexpressionlibrary尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶2（UDPglucosepyrophosphoryla

4、se2,UGP2）是糖原生物合成过程中的一种酶，由508个氨基酸组成，相对分子质量（Mr）约为56000，催化UTP与葡萄糖1P的反应,生成UDP葡萄糖。UDP葡萄糖是主要活化糖的形式，作为葡萄糖基供体参与蔗糖、纤维素、半纤维素、果胶质以及糖脂、糖蛋白的合成代谢［1］。摄入人体内的葡萄糖可在葡萄糖激酶、葡糖磷酸变位酶和尿苷二磷酸葡糖焦磷酸化酶（UGP2）的催化下形成尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）。此外，UGP2还与腺嘌呤二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）相偶联，形成ADPG，参与淀粉的合成［1,.freelatol2007;15(3)抗尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶2单克隆抗体的制备

5、与鉴定材料和方法材料免疫和筛选用成人肝组织胞浆总蛋白，由本室制备。其它主要试剂和仪器包括：弗氏佐剂（Sigma公司产品），羊抗鼠IgGHRP（中山公司产品），蛋白酶抑制剂（Roche公司产品），BCA蛋白定量试剂盒（Pierce公司产品），PVDF膜（Amersham公司产品），ECL反应试剂盒（Amersham公司产品），DY89Ⅱ型电动玻璃匀浆机（宁波新芝生物科技股份有限公司产品）。成人肝组织胞浆总蛋白抗原的制备取10g正常人肝组织加40ml匀浆缓冲液［3］，以每分钟700-750转速率制成肝组织匀浆，然后10000×g离心10分钟，取上清，即获得成人肝组织胞浆总蛋白；采用BCA法

6、测定蛋白浓度，SDSPAGE鉴定抗原的相对分子质量。鼠抗人mAb的制备将成人肝胞浆总蛋白1mg与等体积弗氏完全佐剂混合后进行充分乳化，给BALB/c小鼠多点皮下注射。首次免疫后4周，再加强免疫1次，1周后经尾静脉取血，分离血清，用ELISA法测定效价。融合前3天进行加强免疫，取小鼠脾细胞与X653细胞进行细胞融合，采用杂交瘤技术制备mAb。mAbs的鉴定RF'过夜培养菌接种于LB培养液中，37℃震荡培养至OD600为0.7左右，11.5×g条件下离心10分钟，用10mmol/L的硫酸镁重悬细菌沉淀至OD600为0.5，取适当稀释的文库60μl（含约50000个噬菌体）与600μl重悬的

7、XL1BLUEMRF混匀后37℃温育20分钟，铺至150mm的NZYLB平板上，42℃倒置培养至噬菌斑模糊可见，将浸泡过IPTG的NC膜覆盖表面，37℃继续培养3.5小时，用防水墨水定位后，剥离滤膜，进行常规Dotblot检测。在原位板上回收阳性克隆，用ExAssist辅助噬菌体进行体内剪切、测序。结果成人肝组织胞浆总蛋白的分析成人肝组织胞浆总蛋白的SDSPAGE银染分析结果显示，肝脏胞浆总蛋白的相对分子质量集中在