农杆菌介导ｐｈｙａ基因转化玉米愈伤组织培养体系的优化

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1、农杆菌介导ｐｈｙＡ基因转化玉米愈伤组织培养体系的优化徐丹丹ａ，王丕武ｂ，赵邯郸ａ，刘双ａ，陈昭汀ａ，关淑艳ａ（吉林农业大学，ａ．生命科学学院；ｂ．农学院，长春１３０１１８）摘要：以根癌农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＥＨＡ１０５介导外源基因ｐｈｙＡ转入玉米（ＺｅａｍａｙｓＬ．）自交系ＧＳ０１的胚性愈伤组织，并利用除草剂（草胺磷）筛选出抗性愈伤组织，培养并获得再生植株。结果表明，菌液浓度及侵染时间显著影响愈伤组织的转化率；不同激素种类及配比对抗性愈伤组织再生植株的影响明显。当菌液浓度ＯＤ６００ｎｍ为０．６，侵染时间为２０ｍｉｎ时，抗性愈伤组织的转化率最高，达到了６８．７％，为玉米农杆菌转化

2、并获得再生植株奠定了基础。..关键词：农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）；玉米（ＺｅａｍａｙｓＬ．）自交系；遗传转化；ｐｈｙＡ基因中图分类号：Ｓ５１３．０３２文献标识码：A：0439－８114（２０15）02－0465-03DOI:10.14088/j.ki.issn0439-8114.2015.02.054玉米（ＺｅａｍａｙｓＬ．）是粮食作物中重要的工业原料，在全世界粮食生产中占有举足轻重的地位［１－３］。２０１０年，我国玉米种植面积达到了３２４万ｈｍ２，成为世界第二大玉米生产国，而玉米也成为了我国的“谷物之王”［４］。玉米在我国经济生产中占有重要地位，因此大力提高玉米的产量及品质，成为

3、了众多学者积极探寻的问题［５－７］。植酸酶能有效地水解食物以及土壤中植酸态有机磷，释放出生命体可以直接吸收利用的无机磷酸及其铁、钙、锌、镁等盐类，有效地提高了其生物利用率。因此，植酸酶基因克隆及导入受体组织并获得可再生植株对研制植酸酶食品或饲料添加剂、开发高级保健食品和优质饲料、循环利用土壤中有机磷、缓解全球性磷矿产资源危机等具有重要意义［８－１３］。本研究以玉米自交系ＧＳ０１的胚性愈伤组织为材料，将连有根部特异性启动子和植酸酶基因ｐｈｙＡ的载体转入玉米自交系中，对影响农杆菌介导的玉米遗传转化的因素进行探讨，从而确定了农杆菌介导转化的最佳菌液浓度及最佳侵染时间，优化了农杆菌介导玉米遗传转化条

4、件，并成功获得玉米抗性苗，为基因工程育种打下了基础，为获得含有ｐｈｙＡ基因的转基因玉米植株提供了条件，同时为进一步提高玉米的产量及品质的研究奠定了基础。１材料与方法１．１材料１．１．１外植体采用玉米自交系ＧＳ０１的胚性愈伤组织作为遗传转化的受体进行转化，由吉林农业大学生物技术中心实验室提供。１．１．２菌种含有ｐｈｙＡ基因和玉米根部特异启动子基因构建的重组质粒ｐＣＡＭＢＩＡ３３０１－ＺｍＧＬＵ１Ｐ－ＰｈｙＡ－Ｎｏｓ的根癌农杆菌ＥＨＡ１０５，由吉林农业大学生物技术中心实验室保存并提供。１．１．３培养基本试验所用的培养基见表１。１．２方法１．２．１抗性愈伤筛选标记的确定本研究所构建的表达载体为Ｂａ

5、ｒ基因的筛选标记，筛选培养采用除草剂筛选的方法，即用草胺磷进行筛选。１．２．２农杆菌介导转化玉米愈伤组织１）农杆菌菌液的制备。将带有质粒ｐＣＡＭＢＩＡ３３０１－ＺｍＧＬＵ１Ｐ－ＰｈｙＡ－Ｎｏｓ单菌落，接种于含５ｍＬ卡那霉素的５ｍＬＹＥＰ液体培养基中，于２７℃、２００ｒ／ｍｉｎ培养过夜，再转入５０ｍＬＹＥＰ液体培养基中，培养至对数生长期（ＯＤ６００ｎｍ在０．５～０．６）时，收集菌体，重悬于ＭＳ液体培养基中待用。２）玉米愈伤组织的诱导。取授粉１２～１６ｄ的玉米自交系ＧＳ０１的幼穗，先用７５％乙醇消毒８～１０ｍｉｎ，再用０．５％次氯酸钠浸泡消毒１２～１５ｍｉｎ，无菌水洗２～５次后，在无菌条件下取幼

6、胚接种于诱导培养基上，２６℃暗培养３～４周，产生Ⅰ型愈伤组织，每隔２～３周继代１次，诱导出Ⅱ型胚性愈伤组织，作为农杆菌转化的受体材料。３）农杆菌转化玉米愈伤组织。将含有质粒ｐＣＡＭＢＩＡ３３０１－ＺｍＧＬＵ１Ｐ－ＰｈｙＡ－Ｎｏｓ的农杆菌ＥＡＨ１０５的单菌落，接种于ＬＢ液体培养基（含有５０ｍｇ／Ｌ卡那霉素）中，２７℃、１８０ｒ／ｍｉｎ振荡培养至对数生长期（ＯＤ６００ｎｍ达到不同值），收集菌体，用同体积侵染培养基重悬菌体，用此菌液在三角瓶中侵染胚性愈伤组织１５～２５ｍｉｎ，每隔５ｍｉｎ振荡１次，然后收集菌体，倒掉菌液，将愈伤组织放入铺有无菌滤纸的培养皿中，吸干愈伤组织表面多余的菌液，然后转入共体

7、培养基中（附加２００μｇ／ＬＡＳ）中２７℃暗培养３ｄ左右。４）愈伤组织的筛选、分化及植株再生。将愈伤组织移入筛选培养基中（含一定浓度的除草剂），筛选生长旺盛的新鲜的抗性愈伤继代３次（每１５～２０ｄ左右继代１次），抗性愈伤转至分化培养基中，分化出苗，再转入生根培养基生根。再移栽到培养室盆栽，最后移栽到大田，进行田间栽培。２结果与分析２．１不同菌液浓度对玉米抗性愈伤组织转化率的影响农杆菌的生长时期不同，侵染能力有