丙肝病毒核心基因克隆载体pgemhcv-core的构建论文

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1、丙肝病毒核心基因克隆载体pGEMHCV/core的构建论文【摘要】目的构建丙肝病毒核心基因克隆载体pGEM-HCV/core，为进一步研究外部引导序列（externalguidesequence,EGS）引导核糖核酸酶P在RNA水平阻断丙肝病毒核心基因的表达做好前期基础。方法将含HCV全长基因的pBRTM／HCV1301l质粒于大肠杆菌JMl09内扩增；提取pBRTM／HCV1301l质粒；从pBRTM／HCV1301l质粒中PCR扩增出HCV核心基因片段并将其插入pGEM3Z克隆载体；以得到重组的pGEM-HCV/core克隆载体；最后EcoRIa

2、ndHindIII双酶切鉴定HCV核心基因克隆载体。结果pGEM-HCV/core克隆载体经双酶切、凝胶电泳证明插入片段与HCV核心基因片段大小相符；经测序证明其插入序列与HCVcore基因序列一致。结论成功构建了HCV核心基因的克隆载体pGEM-HCV/core。【关键词】HCV；core基因；载体；EGSAbstract:ObjectiveToconstructthecloneplasmidcontainingthecoregeneofHCV,preparingfortheresearchofblockageoftheexpressionofHCVcore

3、geneguidedbyEGSatthelevelofmRNA.MethodsAfterexpandingplasmidpBRTM/HCV13011(containingtheeofHCV)throughE.coliJM109.Thecoregeneplifiedplate;ThecoresegmentidpGEM3Z.PlasmidpGEM-HCV/coreidpGEMHCV/corehassuccessfullybeenconstructed.Keyeofguidesequence,M1GS)在RNA水平阻断HCV核心基因的表达，为开展包括抗HCV疫

4、苗和药物研发等临床应用提供重要的物质基础。1材料与方法1.1材料大肠杆菌菌株JM109，购自鼎国生物公司。用CaCl2法制备感受态菌，-80℃保存。质粒pBRTM／HCV13011.freelol/L的CaCl2溶液制备JM109感受态菌；将质粒pBRTM／HCV13011及pGEM3Z克隆载体分别转化JM109感受态菌，筛选阳性菌落，小量制备质粒DNA，经酶切及琼脂糖凝胶电泳分析选出含相应质粒的阳性细菌克隆,见图1。将转化有pBRTM／HCV13011及pGEM3Z克隆载体的细菌分别接种于含四环素和含氨苄青霉素的平板中，倒置于生化培养箱37℃恒温培

5、养16h。挑单个菌落分别接种于含四环素和含氨苄青霉素的LB液体培养基中，剧烈振荡过夜，用盖宁微量质粒提取试剂盒提取pBRTM／HCV13011及pGEM3Z。M：MarkerⅢ;1：pBRTM／HCV13011图1pBRTM／HCV13011质粒（略）Fig.1pBRTM／HCV13011plasmid1.4.2HCV核心基因的PCR扩增用PCR方法以pBRTM／HCV1301l质粒为模板扩增HCV核心基因序列，在上游引入EcoRI酶切位点，并在下游引入BamHI酶切位点，并在两端各加入3个保护碱基。PCR的反应程序如下：94℃变性5min，94℃

6、45s，55℃45s，72℃聚合延伸反应5min，共循环30次。PCR产物经DNA片段纯化试剂盒清洁。1.4.3克隆载体的构建先用EcoRI、HindIII分别酶切HCV核心基因片段（PCR回收产物）和pGEM3Z克隆载体，经37℃酶切过夜后用DNA片段纯化试剂盒清洁酶切产物。然后将经双酶切的pGEM3Z克隆载体与HCVcore片段16℃连接过夜。最后将连接产物转化JM109感受态大肠杆菌，于37℃恒温培养16～20h，观察结果。1.4.4克隆载体的鉴定经氨苄青霉素培养基筛选，挑取克隆行EcoRI、HindIII双酶切以及琼脂糖电泳筛选出含有HCV核心蛋白

7、基因片段大小的阳性克隆。阳性克隆者送英俊生物公司测序。2结果2.1质粒的扩增及纯化质粒pBRTM／HCV13011是由HCV全长基因（9.6kb）和pBR322载体(4361bp)重组形成的质粒，大小约为13961bp,如图1所示。pGEM3Z克隆载体大小为2743bp,如图2所示。2.2HCV核心基因的PCR扩增PCR扩增的HCV核心蛋白基因序列约为582bp(由于HCVcore序列为573bp，再加保护碱基和酶切位点9bp共582bp)，PCR扩增结果见图3。M：MarkerⅢ;1：pGEM3Z质粒图2pGEM3Z质粒（略）Fig.2pGEM3Z

8、plasmidM：MarkerDL20