丙肝病毒核心基因克隆载体pgemhcv-core的构建

《丙肝病毒核心基因克隆载体pgemhcv-core的构建 》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、丙肝病毒核心基因克隆载体pGEMHCV/core的构建【摘要】目的构建丙肝病毒核心基因克隆载体pGEM-HCV/core，为进一步研究外部引导序列（externalguidesequence,EGS）引导核糖核酸酶P在RNA水平阻断丙肝病毒核心基因的表达做好前期基础。方法将含HCV全长基因的pBRTM／HCV1301l质粒于大肠杆菌JMl09内扩增；提取pBRTM／HCV1301l质粒；从pBRTM／HCV1301l质粒中PCR扩增出HCV核心基因片段并将其插入pGEM3Z克隆载体；以得到重组的pGEM-HCV/core克隆载体

2、；最后EcoRIandHindIII双酶切鉴定HCV核心基因克隆载体。结果pGEM-HCV/core克隆载体经双酶切、凝胶电泳证明插入片段与HCV核心基因片段大小相符；经测序证明其插入序列与HCVcore基因序列一致。结论成功构建了HCV核心基因的克隆载体pGEM-HCV/core。【关键词】HCV；core基因；载体；EGS　　Abstract:ObjectiveToconstructthecloneplasmidcontainingthecoregeneofHCV,preparingfortheresearchofblockageof

3、theexpressionofHCVcoregeneguidedbyEGSatthelevelofmRNA.MethodsAfterexpandingplasmidpBRTM/HCV13011(containingtheeofHCV)throughE.coliJM109.Thecoregeneplifiedplate;ThecoresegmentidpGEM3Z.PlasmidpGEM-HCV/coreidpGEMHCV/corehassuccessfullybeenconstructed.　　Keyeofguidesequence

4、,M1GS)在RNA水平阻断HCV核心基因的表达，为开展包括抗HCV疫苗和药物研发等临床应用提供重要的物质基础。　　1材料与方法　　1.1材料　　　　大肠杆菌菌株JM109，购自鼎国生物公司。用CaCl2法制备感受态菌，-80℃保存。质粒pBRTM／HCV13011，由美国华盛顿大学Rice教授惠赠，具有HCV全长基因；pGEM3Z克隆载体由本试验室保存。　　1.2主要试剂　　　EcoRI、HindIII、T4DNA连接酶及Taq酶均购自大连宝生物公司。DNAMarkerIII及DNAMarkerDL2000分别购自北京奇华盛生物公司

5、及威佳生物公司。质粒提取试剂盒购自康龙生物公司。DNA片段纯化试剂盒购自尚能生物公司。　　1.3引物　　上游引物：5＇GGCGAATTCATGAGCACGAATCCTAAAC3＇(包含EcoRI位点)；下游引物：5＇CCTAAGCTTGGCTGAAGCGGGCAC3＇(包含HindIII位点)；引物由英俊生物公司合成。　　1.4方法　　1.4.1质粒的扩增及纯化　　应用0.1mol/L的CaCl2溶液制备JM109感受态菌；将质粒pBRTM／HCV13011及pGEM3Z克隆载体分别转化JM109感受态菌，筛选阳性菌落，小量制备质粒D

6、NA，经酶切及琼脂糖凝胶电泳分析选出含相应质粒的阳性细菌克隆,见图1。将转化有pBRTM／HCV13011及pGEM3Z克隆载体的细菌分别接种于含四环素和含氨苄青霉素的平板中，倒置于生化培养箱37℃恒温培养16h。挑单个菌落分别接种于含四环素和含氨苄青霉素的LB液体培养基中，剧烈振荡过夜，用盖宁微量质粒提取试剂盒提取pBRTM／HCV13011及pGEM3Z。　　M：MarkerⅢ;1：pBRTM／HCV13011　　图1pBRTM／HCV13011质粒（略）　　Fig.1pBRTM／HCV13011plasmid　　1.4

7、.2HCV核心基因的PCR扩增　　用PCR方法以pBRTM／HCV1301l质粒为模板扩增HCV核心基因序列，在上游引入EcoRI酶切位点，并在下游引入BamHI酶切位点，并在两端各加入3个保护碱基。PCR的反应程序如下：94℃变性5min，94℃45s，55℃45s，72℃聚合延伸反应5min，共循环30次。PCR产物经DNA片段纯化试剂盒清洁。　　1.4.3克隆载体的构建　　先用EcoRI、HindIII分别酶切HCV核心基因片段（PCR回收产物）和pGEM3Z克隆载体，经37℃酶切过夜后用DNA片段纯化试剂盒清洁酶切产物。然后将

8、经双酶切的pGEM3Z克隆载体与HCVcore片段16℃连接过夜。最后将连接产物转化JM109感受态大肠杆菌，于37℃恒温培养16～20h，观察结果。　　1.4.4克隆载体的鉴定　　经氨苄青