基于报告病毒和细胞活性的抗ev71和ca16病毒药物筛选方法的建立及应用

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1、基于报告病毒和细胞活性的抗EV71和CA16病毒药物筛选方法的建立及应用-->引言1.手足口病介绍手足口病(Hand,footandmouthdisease)是一种常见的儿科疾病，主要感染5岁以下的儿童。手足口病症状通常表现为轻微发热并伴有局部皮疹，少数病人发展为中枢神经系统感染，引起的疾病从无菌性脑膜炎到严重的致命性脑炎[1-4]。从1957年首次报道以来，手足口病在全世界范围内都有报道，主要疫情大多集中在南亚和中国。2008年，中国疾病控制中心根据手足口病的发病率和死亡率，将其被列为丙类传染病。2012年，世界卫生组织报

2、道全世界有超过200万手足口病病例包括600以上的死亡病例，主要分布在中国、越南、日本和新加坡，其中中国共有病例2,198,442例，死亡569例。手足口病的病原体包括20多种肠道病毒(Enterovirus)，其中肠道病毒71型(Enterovirus71,EV71)和柯萨奇A16型(CoxsackievirusA16,CA16)是最常见的两种病原体，约占总发病人数的80%以上[5]。其中，由EV71引起的手足口病可导致严重的并发症，如脑炎、严重肺水肿、休克甚至死亡[6]。大部分CA16感染导致的临床症状相对温和，但是许多

3、最近的报道表明CA16感染可以导致严重的健康问题，如无菌性脑膜炎、心包疾病、肺部并发症、甚至致命的心肌炎和肺炎[7]；且CA16感染的病例较多，据统计占手足口病总感染人数的60%以上[8,9]。因此，对抗手足口病的重点在于研究EV71和CA16病毒的疫苗及药物。虽然手足口病对公众健康持续造成严重威胁，当前仍没有上市的疫苗和针对性的药物[10]。然而近几年在手足口病抗病毒研究方面，尤其是疫苗方面取得了相当的进展，目前国内已有三株抗EV71疫苗完成了三期临床实验，全都展现出了良好的安全性和保护性[11]。............

4、.....................2.抗手足口病药物研究进展现如今，抗病毒药物研究包括手足口病药物研究主要有两种思路：其一是根据病毒功能性蛋白质的结构，虚拟与其结构契合的阻断剂的结构，通过化学合成的方法合成一系列结构类似的药物并筛选出药效最强的药物；其二是从一些已知的有抗病毒效果的中草药中分离和纯化出有效组分，并对其抗病毒机制进行研究。2.1.合成类药物的抗EV71、CA16病毒作用2.1.1抑制病毒侵入与脱壳的化合物假设某种化合物可以与病毒抗原决定簇上的受体结合区（VP1口袋）相结合，就可通过引起峡谷区的构象改变来

5、阻止病毒吸附宿主细胞[20]。此外，化合物插入VP1疏水口袋也可增加毒粒的稳定性，从而使病毒无法完成脱壳作用，阻止病毒RNA释放。数种结合病毒衣壳的分子被确定具有抗EV71病毒的效果。在此类化合物中，研究的最为广泛的是Sterling-)[22]。随后，此团队又对发现的药物进行了多种化学修饰，并发表了一系列抑制活性更强的药物，如BPR0Z-194(IC50=1.55μM)。和BPR0Z-194相比，BPR0Z-103的苯氧基由一个氯苯基代替，增强了约10倍的效力(IC50=0.13μM)；BPR0Z-299则用一个三氟甲基恶

6、二唑代替，抗病毒效力增加70倍以上(IC50=0.021μM)[23-25]。在苯氧基环上加上一个肟醚得到的BPR0Z-101，抗EV71活性得到了巨量的增加(IC50=0.0012μM)[26],而在在咪唑烷酮和联苯间链接的位置引入一个甲基后抗病毒药物活性也明显增强(BPR0Z-033,IC50=0.0088μM)[27]。根据大小和疏水力设计出的BPR0Z-074是最有效的抑制剂，IC50达到0.0008μM。作用阶段实验显示，咪唑啉酮可有效抑制EV71病毒的早期感染，VP1很可能是这些化合物的靶向分子。当前此研究组正积

7、极地研究这些化合物对治疗的潜在可能性（图1.2）。..................................第一章筛选方法的建立及应用第一节报告病毒的制备1.材料与方法1.1实验材料1.1.1细胞人横纹肌肉瘤细胞（RD细胞）、人胚肾细胞（293T细胞）、非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）均购自ATCC，均使用含10%的胎牛血清（购自TBD公司）DEME培养基（购自Sigma公司）培养。RDS细胞系，即稳定过量表达病毒受体hSCARB2的RD细胞系，用含10%胎牛血清的DEME培养基加筛选抗生素嘌呤酶素(浓度为0.5μg

8、/ml，购自Clontech)培养。本细胞系由本室的其他研究员构建[54]，主要构建方法为：将合成的两端有EcoRIXbaI酶切位点的EV71/CA16受体hSCARB2基因片段（GenBank:NM_005506.3，由上海捷瑞公司合成）插入慢病毒载体Lenti-XpLVX-Purove