基于人工miRNA技术筛选抗登革病毒和乙型肝炎病毒靶标

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1、中图分类号R917UDC6lO硕士学位论文学校代码!Q墨3兰密级公珏基于人工miRNA技术筛选抗登革病毒和乙型肝炎病毒靶标Screeningoftheanti·-denguevirusandanti—·hepatitisBvirustargetsbasedontheartificialmiRNAbiotechnology作者姓名：谢佩雯学科专业：药学研宄方向：药物分析学学院(系、所)：．药学院指导教师：王升启副指导教师：王学军论文答辩日期也!墨：垒：11答辩委员会主席中南大学二。一三年五月猢力似原创性声明

2、本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：日期：迎臣年豆月且日学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全

3、部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。作者签名：勉监导师签名组日期：兰生年—甥旦日基于人工miRNA技术筛选抗登革病毒和乙型肝炎病毒靶标摘要：目的：本课题利用人工miRNA(artificialmiRNA，amiRNA)技术分别从靶向病毒寻找抗登革病毒靶点和靶向宿主筛选抗乙型肝炎病毒宿主靶标两个方面进行探索研究。方话：1．病毒靶向筛选抗登革病毒靶点：(1)构建人工miRNA表达载

4、体，慢病毒表达载体；(2)观察感染登革病毒细胞的病变情况；(3)CCK-8法检测细胞的生存率；(4)间接免疫荧光法检测登革病毒包膜E蛋白的表达；(5)蚀斑试验检测细胞感染上清登革病毒的滴度；(6)半定量RT-PCR法检测细胞内登革病毒和干扰素相关基因mRNA的表达。2．宿主靶向筛选抗乙型肝炎病毒宿主靶标：(1)构建人工miRNA慢病毒表达载体；(2)ELISA法分别检测培养上清HBsAg和HBeAg的表达；(3)荧光定量PCR法检测培养上清HBVDNA的表达；(4)嘌呤霉素筛选AFP—amiRNA稳转He

5、pG2细胞；(5)RT-PCR法检测稳转细胞内AFPmRNA的表达；(6)间接免疫荧光法检测稳转细胞AFP蛋白的表达；(7)ELISA法定量检测稳转细胞上清AFP蛋白含量。结果：1．病毒靶向筛选抗登革病毒靶点：针对登革病毒保守区设计amiRNA，根据细胞病变情况初筛得到对感染DENV-2的细胞有保护作用的6条amiRNA，其中DEN-V-128组细胞生存率为90％，是DENV组的1．8倍，病毒包膜E蛋白的表达也大大降低：选用抗病毒效果显著的DENV-128与其余5条有效amiRNA两两串联后通过细胞病变情

6、况观察、CCK-8检测、细胞间接免疫荧光实验筛选得到效果明显的串联序列DENVl28—1382，其细胞生存率为98％，是DENV组的1．6倍，病毒包膜E蛋白的表达降低；进一步构建并包装表达DENV-128、DENVl28．1382的慢病毒载体，通过CCK-8法检测细胞存活率、间接免疫荧光法检测病毒包膜E蛋白的表达情况、半定量RT-PCR检测DENVmRNA含量、蚀斑试验检测感染上清液的病毒滴度、干扰素反应检测amiRNA是否激活内源性干扰素反应等实验验证了amiRNA对登革病毒复制的特异性抑制效果。2．宿

7、主靶向筛选抗乙型肝炎病毒宿主靶标：针对可能与HBV感染复制相关的33个宿主分子设计amiRNA，采用amiRNA慢病毒表达载体与HBV表达载体瞬时共转染HepG2肝癌细胞，以细胞上清HBsAg和I-meAg表达水平作为评价指标筛选得到3个宿主分子(作用效率>30％)；选择甲胎蛋白基因(AFP)进行深入研究，针对AFP设计5条amiRNA，经HBsAg、HBeAg和HBVDNA检测结果得到瞬时转染对HBV复制抑制率较高的AFP．559和AFP．1621两条amiRNA序列，其中AFP．559对HBsAg表达

8、抑制率为59％(96h)，对I-／BeAg表达抑制率为44％(96h)，对HBVDNA抑制率达40％，AFP一1621对HBsAg表达抑制率为49％(96h)，对HBeAg表达抑制率为33％(96h)，对HBVDNA抑制率达37％；然后通过包装慢病毒建立了AFP的稳定沉默HepG2细胞，RT-PCR、细胞间接免疫荧光及AFP蛋白定量实验显示AFP的mRNA与蛋白表达均被显著抑制，证明稳转细胞构建成功。结论：1．针对登革病毒保守