humanin的基因克隆及序列测定论文

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1、Humanin的基因克隆及序列测定论文靳辉，王唯析，杨广笑，王全颖，胡海涛，韩太真【关键词】阿尔茨海默病作者简介：靳辉(1973)，女(汉族),解剖学硕士.研究方向：阿尔茨海默病的病理机制及防治.摘要：目的利用基因工程方法对Humanin进行基因克隆并测定其序列，为进一步对阿尔茨海默病进行基因治疗奠定基础。方法采用非对称互补引物/模板法.freelanin的cDNA，将其克隆入pVAXI载体中并测序。结果经酶切鉴定、测序分析，表明所插入的基因片断为Humanin基因，与设计完全相同。结论成功地克隆了Huma

2、nin基因。关键词：阿尔茨海默病；Humanin；基因克隆；序列测定ABSTRACT:ObjectiveTousegeneengineeringtechniquetocloneandsequencetheHumanin.MethodsBymeansofasymmetricalprimer/template,doublestrandedcDNAofHumaninessitesonthetes.ThenthecDNAidpVAXIandsequenced.ResultsEvidencesofDNAsequenc

3、eanalysisandrestrictionenzymesdigestionshoentanincDNA,consistententanincDNAer'sdisease;Humanin;genecloning;sequencing阿尔茨海默病(Alzheimersdisease,AD)是以进行性的记忆减退、认知障碍和痴呆为临床表现的老年人常见疾病，发病率随着人口的老龄化而迅速增加，已成为继心血管疾病、癌症和中风之后的又一严重危害人类健康的疾病。目前世界各国均在积极寻找防治AD的有效措施。近年，日本学者首

4、先从AD患者未发病的大脑枕叶分离出一种称为Humanin(HN)的短肽。它能有效抑制AD相关基因：淀粉样蛋白前体(amyloidprecursor,APP)基因、早老素1(presenilin1,PS1)基因、早老素2(presenilin2,PS2)基因的突变，以及β淀粉样肽(amyloidpeptide,Aβ)引起的神经细胞死亡，且Humanin的一种衍生物――Humanin(HNG)，被证实作用较HN强1000倍。迄今，Humanin及其衍生物的作用机制仍不十分清楚。为了深入研究其对AD的作用机制以及

5、为开发新的更为有效的抗AD药物提供参考，我们首次在国内对HNG进行基因克隆。1材料与方法1.1材料大肠杆菌E.coliDH5α、质粒载体pVAXI由西安华广生物工程公司提供。限制性内切酶KpnⅠ、XhoⅠ、SalⅠ及T4DNA连接酶，均购自华美生物工程公司。1.2HNGDNA的设计与合成根据Hashimoto等人提供的HN基因序列，将其第14位丝氨酸碱基AGT换为甘氨酸碱基GGG，形成HNG基因序列，在其前后分别加入质粒载体pVAXI多克隆位点上的两个单一酶切位点KpnⅠ和XhoⅠ，并在HNG基因编码区的下

6、游引入了一个载体上没有的酶切位点SalⅠ。设计HNG非全长、部分互补的两条单链DNA，使其互为引物、互为模板制备全长HNGcDNA。序列如下：正链：CGGTACCATGGCTCCACGAGGGTTCAGCTGTCTCTTACTTTTAACCGGGGAAATTG；负链：GCCTCGAGCGTCGACTGCCCGCCTCTTCACGGGCAGGTCAATTTCCCCGG(正链中GGTACC为KpnⅠ酶切位点，GGG为第14位甘氨酸的编码碱基；负链中CTCGAG、GTCGAC分别为XhoⅠ、SalⅠ酶切位点；下划

7、线部分为12个互补碱基)。以上序列均由上海生物工程有限公司合成，PAGE纯化。1.3重组质粒的构建将上述正负链退火后再以Klenoarker前方，大片段位于λDNA/HindⅢmarker2322bp与4361bp之间(图2C)，此两片断与理论值81bp及2935bp相符。此6份质粒用SalⅠ消化，可见质粒被线性化，只有一条条带(图2D)，位置与未经酶切的重组质粒(图2E)相近(图2)。图2pVAXI/HNG重组质粒酶切鉴定图谱（略）2.3测序结果采用电脑DNA分析辅助软件，将上海生物工程有限公司测定的基因

8、序列进行分析，结果发现该序列与设计完全相同。3讨论HN是一种新近发现的神经保护肽，含24个氨基酸残基(MetAlaProArgGlyPheSerCysLeuLeuLeuLeuThrSerGluIleAspLeuProValLysArgArgAla)，其基因序列首先由日本研究者Hashimoto等人从尸检诊断为AD病病人未发病的枕叶cDNA文库中筛查得出，其mRNA与线粒体16srRNA基因组有99.9%的同源性。