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1、靶向ASGPR的反义核酸体外抗HBV作用论文【摘要】目的研究以宿主基因ASGPR为靶的反义核酸的抗-HBV作用,为HBV感染的用药提供新的思路。方法以HepG212115细胞为靶细胞,脂质体为载体将靶向ASGPR的硫代反义寡核苷酸(ASODN)转染至HepG212115细胞中,72h后收集细胞培养液,采用酶联免疫法及荧光定量PCR法测定细胞培养液中HBsAg、HBeAg。结果结果表明，随着浓度的升高，ASODN抗HBsAg,HBeAg和HBVDNA的作用逐渐增强。当ASODN高于0.5μmol/L.时作用逐渐减弱。结论ASODN具有抗HBsAg,HB
2、eAg和HBVDNA的作用。【关键词】寡核苷酸反义乙型肝炎病毒【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheinhibitoryeffectsagainstHBVofaphosphorothioateantisenseoligodeoxynucleotide“ASODN”targetedtoASGPRinvitro.TheassayattemptedtoaccessaneethodandideatorefreshthethinkingentbytheASODNtargetedtoasialoglycoproteinrecept
3、or(ASGPR).Methods(ASGPR)mRNAediaediuminedbyreal-timePCR.HBsAgandHBeAgol/L.ConclusionItisconcludedthatundercertainexperimentalconditions,theASODNisapoRNA的二级结构设计并筛选出的反义寡核苷酸(anti2senseoligodeoxynucleotide,ASODN),能有效地抑制HepG212115细胞分泌的HBsAg、HBeAg、HBV-DNA12.,本实验以HepG212115细胞为模型,观察ASO
4、DN的抗-HBV作用。1材料与方法1.1细胞培养HepG212115细胞由本实验室保存,用含10%胎牛血清(FBS,Gibco),380μg/mlG418(Promega)的MEM细胞培养液置37℃,5%(体积分数)CO2孵箱培养。1.2试剂Lipofectin购自美国Invitrogen公司,乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒购自华美生物工程公司,乙型肝炎病毒e抗原诊断试剂盒购自华美生物工程公司。1.3寡核苷酸的制备ASODN(5′2CCTCCCAGGACGT2GACCACC23′)由ABI8909型自动DNA合成仪合成并在合成时进行硫代修饰,用Mic
5、roPureⅡ反向纯化柱(OligoPrepOP120,SAVANT)纯化。1.4HepG212115细胞给药在96孔板中,每孔加入含6×103个HepG212115细胞的100μl的细胞培养液,置37℃,5%CO2孵箱培养72h。用Lipofectin按照其说明书进行A2SODN转染。ASODN终浓度为011μmol/L、012μmol/L、014μmol/L。分别取ASODN的3个浓度(011μmol/L、012μmol/L、014μmol/L),每个重复3个孔。以不给药组作为空白对照组。继续培养72h后收集培养液,-20℃保存备用。1.5寡合甘
6、酸药对HepG212115细胞分泌HBsAg、HBeAg的抑制作用检测将收集好的培养液按照乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒(华美生物工程公司),乙型肝炎病毒e抗原诊断试剂盒(华美生物工程公司)说明书操作。各取50μl培养。液加入表面抗原及e抗原包被的96孔板中,再加入50μl相应的酶标结合物,37℃孵育1h。相应洗液洗板5次,再依次加入50μl显色液A及50μl显色液B,37℃避光显色15min,最后加入50μl终止液。在多标记酶联免疫检测仪(VIC2TORTMultilabelCounter,g2+,2μl模板,混匀后将各反应管与标准曲线反应管一起放
7、入iCycle自动PCR仪中进行扩增,扩增条件为:94℃30s,55℃30s,72℃30s,共40个循环,反应后由电脑自动计算出定量结果。2结果2.1寡核苷酸药对HepG212115细胞分泌HBsAg、HBeAg的抑制2.1.1.寡核苷酸药对HepG212115细胞分泌HBsAg的抑制。从表1中可以看出,随着ASODN浓度的增加,对HBsAg的抑制率增强。ASODN取0.5μmol/L时对HBsAg的抑制率达到最高峰，取0.6μmol/L和0.7μmol/L时对HBsAg的抑制率逐渐下降。2.1.2寡核苷酸药对HepG212115细胞分泌HBeAg的
8、抑制随着ASODN浓度的增加,对HBeAg的抑制率增强。ASODN取0.4μmol/L时对HBeAg的抑制率
