反义核酸技术.doc

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1、反义核酸技术RNA干扰技术天然反义RNA广泛存在于原核和真核细胞内，通过与靶基因形成RNA-RNA或RNA-DNA双螺旋，对基因功能起重要的调节作用。RNA干扰技M^(RNAinterference,RNAi)正是利用了反义RNA与正链RNA形成双链RNA，特异性抑制靶基因轉录後表达这八原理，成为研究轉录後调控的有效工具，广泛用于功能基因组学、基因治疗和轉录调控机制研究。在这一技术中，早期使用双链RNA(double-strandRNA,dsRNA)作为干扰剂，核心技术是小分子干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA)的设计与合成(哺乳动物通常选择21〜23bp

2、dsRNA，其他生物选择更长的片段)，另外，还包括siRNA的标记、轉染和RNAi的检测。然而，基因敲除实验显示RNAi存在一定程度的非特异性。分析认为,RNAi最初在哺乳动物细胞中所获得的成功，部分是由于所使用的短链dsRNA激活了胞内dsRNA依赖的蛋白激酶,引起细胞反应并不断累积。新近两方面技术的发展使得RNAi在哺乳动物细胞屮更加奏效:⑴使用能使siRNA稳定表达的新的载体系统[21];(2)利用人U6核内小RNA(snRNA)启动子进行单一RNA轉录单位的核内表达[22]。即通过轉染dsRNA的胞内表达并在胞内降解成约20bp的dsRNA,後者通过RNA依赖的RNA合成酶复

3、制，并结合到核酸酶复合物上，形成RNA诱导的轉录沉默复合体(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)，降解靶mRNAo反义寡核昔酸反义寡核昔酸主要通过RNaseH介导的机制抑制基因表达。RNaseH是一种降解RNA2DNA杂交链中RNA的酶，产生5’■磷酸和3’-0H端。RNaseH酶切产物因缺少5’-cap和3’・polyA尾而被细胞中的5’和3’外切酶降解。这种高效的方法己被广泛用于含有反义寡核昔酸序列样的靶基因的下ij»l（downregulation）。实际上，这种技术对于鉴定mRNA中的有效靶基因在某种程度上靠经验，因为许多靶基因不能显示最佳活性。

4、可以通过增加反义寡核昔酸的种类克服这种局限，如在96孔板上进行PCR後，同吋使用80种以上的反义寡核昔酸进行同一个mRNA表达的研究。整个过程仅用4〜5d。因此，这是一种高通量的基因功能检定方法[16]o化学修饰如2’■甲氧基乙基化⑵-0-（2-methoxy）ethyl,2r-MOE）可降低细胞中核酸酶对寡核昔酸的降解作用，因而得到越来越多的研究应用。反义寡核昔酸技术己被用丁多种系统的基因功能研究，如蛋白磷酸化酶、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制剂p27/kip(cyclin-dependentkinaseinhibitorp27/kip）、凋亡蛋白抑制剂survivin和抗凋亡蛋白

5、BCL-XLo反义技术广泛用于体内外模型中靶基因功能的验证，可部分替代基因敲除技术。干预转录、mRNA前的剪接和翻译过程，可竞争转录、蛋白合成或致mRNA降解。迄今为止，AS-ODN的作用机制尚未完全清楚，但较多理论和实验表明其可能的机制为：（1）设计AS-ODN定向互补到靶mRNA,严格按Waston-Crick碱基互补配对，从而抑制mRNA的表达。与AS-ODN结合的mRNA,还可能阻断mRNA从核内进入胞装，使其蛋白质的翻译过程不能正常进行，从而阻断了翻译过程。有研究发现AS-ODN与mRNA之编码区配对结合就足以阻断mRNA的翻译功能，而另外一些研究则证明AS-ODN与mRN

6、A的5'端非翻译区（是高度保守的序列）的结合才能取得最佳结果。（2）AS-ODN进入细胞核内以Hoogsteen键连接到核内基因组DNA,即ODN直接与DNA双链的特定部位结合形成三聚体，或ODN与mRNA形成的双链与DNA双链竞争转录因子的结合，导致转录过程不能启动，转录被阻断。（3）非特异性的作用机制是AS-ODN与靶蛋白以aptamer式连接，从而抑制了蛋白质的加工、修饰及功能的表达。1.2反义核酸的种类及义核酸通常根据其作用方式可分为三类：（1）一种是把特异的反义核酸连接到特定的表达载体上（病毒、质粒），导入靶细胞直接转录出反义RNA,与相应mRNA形成双链，阻断rRNA的翻

7、译过程。（2）人工合成或生物合成的ODN,以胞吞的方式进入细胞与相应的mRNA结合发挥用。（3）核酶（ribozyme）是--类能在特异序列位点催化RNA切割的小片段ODN链。其作用原理是核酶特异性序列通过互补碱基对形成识别并结合特异性靶RNA,催化核心则以酶的效率催化裂解靶RNA,使目标失活并无法恢复，从而达到治疗目的