鹅膏蕈碱对c6胶质瘤细胞的毒性作用研究论文

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1、鹅膏蕈碱对C6胶质瘤细胞的毒性作用研究论文毕晓颖伍凤平李亚梅郭杰【摘要】目的比较不同浓度的鹅膏蕈碱（αamanitin）对C6胶质瘤细胞毒性作用。方法采用体外培养方法。结果C6胶质瘤细胞在不同浓度的鹅膏蕈碱分别作用12和24h后呈无规律改变；但48h后，随着浓度的增强，C6胶质瘤细胞的增殖能力越来越差，细胞坏死也随之增多。结论鹅膏蕈碱对C6胶质瘤细胞作用一定的时间后，对C6胶质瘤细胞的抑制作用随浓度的增加而增加，呈浓度依赖性。【关键词】鹅膏蕈碱（αamanitin）；C6胶质瘤细胞；毒性鹅膏蕈碱是真菌门，担子菌衙门，担

2、子菌纲.freelRNA合成减少〔1～4〕，从而导致蛋白质合成减少，引起细胞死亡，其化学性质很稳定，耐高温。它是一种无色物质，易溶于甲醇，液体氨，吡啶，也溶于水〔5〕。本实验拟通过细胞形态学和MMT法检测细胞的存活数，探讨鹅膏蕈碱对C6胶质瘤细胞的毒性作用。1材料与方法1.1材料与试剂无菌实验设备；CO2孵箱；倒置显微镜；96孔培养板。C6胶质瘤细胞株购于ATCC(Rockv,MD)。IMDM培养基购于Gibco公司。含10%胎牛血清。鹅膏蕈碱和MTT购于Sigma公司。1.2方法采用MTT测定方法，活细胞线粒体中的琥珀酸

3、脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶的蓝紫色结晶物（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，结晶物形成的量与细胞数成正比〔6〕。取4块96孔培养板每孔分别加入100μl含1×103胶质瘤细胞的细胞悬液，增殖组同时加入100μl不同浓度（0.25、0.5、0.75、1、5、10、25、50、100μg/μl）鹅膏蕈碱于前9列孔中，第10列孔不加，培养3d，用倒置显微镜观察细胞生长

4、情况，继续培养48h后加MTT。MTT组板同样地加入不同浓度的鹅膏蕈碱，继续培养，然后分别于培养12、24、48、72h后加入MTT。测定各孔吸光光度值，计算细胞存活数。1.3统计学分析采用随机区组设计的方差分析。2结果2.1形态学改变培养3d后，用倒置显微镜观察培养板C6胶质瘤细胞呈多突起形状，与培养前相比数量明显增多，贴壁情况好；鹅膏蕈碱作用于细胞12h后，细胞出现萎缩现象，但不同浓度之间没有明显的区别；作用24h后萎缩现象加重，有的甚至已经坏死，但萎缩和坏死的程度并未随浓度增大而增强；48、72h后有明显坏死，且具有

5、浓度依赖倾向。增殖组培养板由于细胞培养加入鹅膏蕈碱，浓度为100μg/μl作用72h细胞几乎无增殖，原有细胞大多已坏死且不贴壁；随着浓度降低，5μg/μl作用72h时细胞部分萎缩坏死，有增殖贴壁现象；浓度为0.25μg/μl作用72h时细胞无坏死，细胞密度大增殖旺盛（见图1）。2.2两组存活细胞百分数比较C6胶质瘤细胞存活数与不同浓度鹅膏蕈碱作用24h前无明显变化，不同浓度鹅膏蕈碱作用48h后，随着浓度增加，C6胶质瘤细胞存活数也随之减少(P＜0.05,P＜0.01)，且有剂量依赖性(见表1)。表1C6胶质瘤细胞在不同浓度

6、鹅膏蕈碱的作用下各个时间点的存活细胞百分数3讨论鹅膏多肽毒素在生命科学的应用主要表现在5个方面：真核生物mRNA合成的专一性抑制剂;基因的组织结构和细胞定位;基因的表达和调控;肿瘤和病毒的研究;细胞结构与功能〔8〕。本实验在鹅膏蕈碱抗肿瘤方面做了部分研究。张志光等人在比较鹅膏毒素对真核生物RNA聚合酶Ⅱ的抑制作用时，发现用含有鹅膏蕈碱毒素的粗提取液培养新鲜绿豆，绿豆生长一定时间后就不再生长，说明鹅膏蕈碱对新鲜绿豆的生长有抑制作用,且这种抑制作用随着鹅膏蕈碱毒素含量的增多而明显〔6〕。对人类而言,鹅膏蕈碱是有毒蘑菇中的一类慢

7、作用毒素,误食后8～10h才会有反应,先是剧烈的上吐下泻,之后有3d左右的假愈期。其间,鹅膏毒肽由于在胃肠道中存在肠肝循环而反复在体内被吸收,对肝脏及其他器官持续造成危害,若抢救不及时,一般中毒后5～12d死亡。鹅膏蕈碱毒素毒理机制现在已经有了比较定性的结论。鹅膏毒肽主要抑制真核生物的RNA聚合酶活性。由于发现了随着鹅膏蕈碱作用时间的延长,RNA的量逐渐减少的现象，经研究发现鹅膏蕈碱是通过抑制RNA聚合酶Ⅱ而使细胞不能合成新的mRNA，导致蛋白质合成减少，引起细胞死亡。其具体抑制过程为：RNA合成时，由于鹅膏蕈碱的作用，R

8、NA链在延长过程中形成一个新的磷酸二酯键，因此在合成的第二步—转位时，鹅膏蕈碱在原来多用基础上，使酶和模板DNA及新生RNA形成一种三元络合物，从而使酶的催化部位受阻，不能合成新的mRNA〔3〕，导致细胞死亡。本实验中，鹅膏蕈碱对C6胶质瘤细胞也呈现慢作用毒性。鹅膏蕈碱12和24h组由于作用时间太短，不