人苯丙氨酸羟化酶基因克隆及其原核表达质粒的构建论文

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1、人苯丙氨酸羟化酶基因克隆及其原核表达质粒的构建论文张志，黄宗青，沈琪，刘洪涛，邓英太，李爱东，周国强，汪华侨.freelentas),QIAquickGelExtractionKit、QIASpinMiniprepKit(QIAGene)、T4?鄄DNALigase(Invitrogen)。大肠杆菌DH5α为中山大学达安基因中心提供。1.1.2主要设备玻璃匀浆机、高速冷冻离心机、恒温摇床、恒温培养箱、－80℃冰箱（日本SANYO公司）、PE9600PCR扩增仪、ABI3100AvantDNA测序仪（美国PE公司）。1.2方法1.2.1引物设

2、计GeneBank上登录PAH基因mRNA序列(GI：18765884)，在PrimerPremier5.0和Olig6.0软件设计引物扩增PAH的编码序列(CDS)，5′端设计KpnⅠ和EcoRⅠ酶切位点加上3个保护碱基。引物由上海生工合成。1.2.2目的基因的获得从人新鲜肝脏标本Trizol法提取总RNA，检测A260和A280值，计算浓度，－80℃保存。取RNA2μg采用RevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit合成cDNA(plementDNA)。以PAHcDNA为模板做RT－PCR。反应条件:93

3、℃10min、93℃45s、56℃45s、72℃1min，35个循环后,72℃10min。PCR产物浓缩后在0.8%琼脂糖上电泳（1377bp），用QIAquickGelExtractionKit割胶纯化，1％琼脂糖电泳鉴定、拍照、－20℃保存。1.2.3PCR产物克隆和鉴定克隆反应体系:纯化的PCR产物4μL、pMD18-TVector1μL、LigationSolutionI5μL，16℃过夜，得到pMD18-T/PAH质粒，转化感受态大肠杆菌DH5a，涂含氨苄青霉素LB平板，IPTG进行蓝白斑筛选。挑取白色菌落，体外扩增并PCR初筛后

4、菌液抽提pMD18-T/PAH质粒，用KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切并测序鉴定。测序正向引物为M-47,反向为M-48,.freelRNA序列(GI:18765884)一致,pMD18-T/PAH5′端起始密码子(ATG)和3’端终止子(TAA)及两侧KpnⅠ和EcoRⅠ限制性内切酶的识别序列均完整。2.6重组表达质粒测序结果测序结果表明pTrcHis-PAH质粒序列与GeneBank上PAH基因mRNA序列(GI:18765884)一致,pTrcHis-PAH质粒（图１）5′端起始密码子(ATG)和3′端终止子(TAA)及两侧KpnI和Eco

5、RI限制性内切酶的识别序列均完整,序列完全正确，未见框移和突变(图４)。3讨论PKU是1934年法国医生Folling首次报道。PKU是常染色体隐性遗传病，其致病基因PAH基因已经成功分离、克隆5。PAH基因定位于12号染色体(12q22-12q24.1)，大约由1.5Mb碱基组成。PAH基因是断裂基因，mRNA为2.4kb，编码区包含13个外显子和12个内含子。mRNA大小为1353bp，翻译成含451个氨基酸的酶单体6,7。PKU是由于PAH基因突变导致PAH酶的催化活性减弱或消失引起1。迄今全世界已经发现PKU有524多种不同类型的突

6、变（.mcgill.ca/pahdb）。1997年后PKU分子遗传学的研究热点逐渐转为PAH基因突变的功能研究，即进入PAH后基因组学研究，我国学者也在这个领域做了大量的工作，发现了很多新的突变8。迄今全世界共发现70余种致病突变，导致PAH酶的催化功能减弱或消失，引起体内苯丙氨酸的蓄积致病9,10。我们于2003年采用荧光PCR技术成功建立经典型PKU的基因诊断方法11。鉴于目前国内外研究PKU基因治疗的报道尚少，为了探讨PKU的新型基因治疗方法，弥补PKU治疗的缺陷，本研究采用基因工程技术，根据Genebank中PAHcDNA序列,自行

7、设计一对引物,分别在引物5′端和3′端设计KpnI和EcoRI酶切识别位点,并添加保护碱基,扩增包括目的基因在内的全部序列,PCR产物克隆入pMD18-T载体构建pMD18-T/PAH质粒，KpnI和EcoRI双酶切鉴定后全长测序证实pMD18-T/PAH质粒序列完整、正确，即包含起始密码、终止密码及两端的KpnI和EcoRI识别序列。pMD18-T/PAH质粒双酶解消化，目的基因片段定向克隆入pTrcHisB表达载体，蓝白斑筛选挑白色菌落，PCR初筛后转化入TOP10菌体中扩增，抽提重组质粒，KpnⅠ和EcoRⅠ双酶解鉴定，最后全长测序。

8、测序结果表明我们获得的pTrcHisB/PAH质粒序列与GeneBank上PAH基因cDNA序列(GI:18765884)一致,且pTrcHis/PAH质粒中5′端起始密码子(A