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1、新的肾上腺脑白质营养不良基因突变1例的鉴定论文兰风华杨渤生卢爱薇黄梁浒朱忠勇【关键词】肾上腺白质营养不良IdentificationofanovelmutationintheALDgeneofaChinesepatientutationalgenotypeinaChinesefamilytheperipheralbloodofthepatientandALDmRNAplifiedbylongRTPCR.ThePCRproductsentspanningthemutationplifiedfromthegenomicDNAofthepatientandhisfamilym
2、embersanddigestedeBspLI.RESULTS:Cutationhismother,utation.Hisfatherandsisterthismutation.CONCLUSION:Anovelmutation,theP508Lmutation,isfoundintheALDgeneofaChinesepatientutation,missense;ALDprotein【摘要】目的：对1例肾上腺脑白质营养不良（ALD）患者及其家系成员的ALD基因的突变类型进行鉴定.方法：以外周血RNA为模板，采用长链RTPCR技术，分4个片段扩增ALD基因mRNA的编
3、码序列，对4个PCR产物进行直接测序，筛查整个基因编码区.通过限制性内切酶酶切分析患者及其家系成员基因组ALD基因片段，以进一步确证所发现的基因突变.结果：位于患者ALD基因第6外显子的第508位密码子存在一个新的错义突变CCC→CTC(P508L)，患者母亲为突变携带者，患者父亲和妹妹不存在此突变.结论：发现中国ALD患者一个新的ALD基因突变.freelgL-1,22碳饱和脂肪酸（C22∶0）浓度：9.05mgL-1，两个浓度比（C24∶0/C22∶0）等于1.49(正常范围0.939左右).患者非近亲婚配所生，另有一妹妹，无家族史.临床诊断：肾上腺脑白质营养不良（
4、儿童脑型）.1．2方法ALD基因的mRNA长3.7kb，其中编码区为2238bp.本研究合成4对引物［2］，即：PIF和RT1,PⅡF和RT2,PⅢF和RT3,PⅣF和RT4，分4段（自5′端依次为ALD1,ALD2,.freelL，按Qiagen产品（RNeasyMiniKit）说明书提取总RNA.长链RTPCR按TaKaRa试剂盒（RNALAPCRTMKit）说明书进行.先进行反转录，然后在PE2400型热循环仪上进行PCR反应：94℃变性2min后，按94℃30s,60℃30s,72℃2min循环30次.最后一个循环结束后继续在72℃延伸8min.将上述PCR混合
5、物10~20μL上样于15gL-1的琼脂糖凝胶电泳，切下含预期片段（2440bp）的胶块，利用Qiagen的DNA凝胶回收试剂盒（QIAquickGelExtractionkit）从胶块中回收DNA.以此DNA为模板，组配4个2次PCR反应：反应体积50μL，含模板1ng,引物各25pmol,4种dNTP各0.2mmolL-1,Taq酶（BioAsia）2.5U,MgCl21.5mmolL-1，分别扩增ALD1,ALD2,ALD3,ALD4，扩增条件统一为：94℃预变性2min后，按94℃30s,50℃30s,72℃60s进行10~15个循环，最后一个循环结束后继续在7
6、2℃延伸9min.用Qiagen的PCR产物纯化试剂盒（QIAquickPCRPurificationKit）直接从PCR混合液中纯化PCR产物.将纯化的4个片段连同相应PCR引物，寄上海博亚生物技术有限公司进行序列测定.1．2．2基因组DNA片段扩增和限制性内切酶分析患者及其家庭成员的外周血基因组DNA使用Qiagen的DNA提取试剂盒（QIAampDNABloodMiniKit）提取.根据突变所在部位，用Omiga2.0软件设计针对外显子6全长序列的PCR引物，上游引物(PA5F)序列为：5′CTGCGCTCTCTGGCGTCA3′，下游引物（PA5R）序列为：5′
7、CACAGCCCGTCTCTGGCT3′，预期扩增片段长330bp.扩增条件：95℃预变性4min后，按94℃30s,55℃30s,72℃30s进行30个循环.用Qiagen的PCR产物纯化试剂盒（QIAquickPCRPurificationKit）从PCR混合液中纯化PCR产物.根据突变的性质，用限制性内切酶BspLI（MBIFermentas）对纯化的PCR产物进行酶切,于100gL-1聚丙烯酰胺凝胶上电泳,溴化乙啶染色后用美国BioRad公司的FluorS型凝胶成像仪采集电泳结果.2结果2．1ALD基因mRNA的RTPCR扩增及测
