大鼠视上核和室旁核神经元钾离子氯离子共转运体2表达探讨论文

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1、大鼠视上核和室旁核神经元钾离子氯离子共转运体2表达探讨论文王德广，张静，陈菲菲，郑殿杰，陈幽婷【摘要】目的观察神经元特异性标记物钾离子氯离子共转运体2在成年大鼠下丘脑视上核和室旁核的表达。方法成年SD大鼠，4％多聚甲醛灌注固定，取脑，冰冻切片.freelchlorideioncotransporter2inadultratsupraopticandparaventricularnuclei.MethodsTheadultSDratsaldehydetoremovethebrainforfrozen-sectioning.Theexpressionofpotassiumch

2、lorideioncotransporter2andNeuNrevealedbyimmunofluorescenceicroscope.ResultsTheexpressionofpotassiumchlorideioncotransporter2thesupraopticandparaventricularnuclei.ConclusionTheneuronalspecificpotassiumchlorideioncotransporter2isabsentinthesupraopticandparaventricularnuclei.Keyus;supraoptic

3、nucleus；paraventricularnucleus；potassiumchlorideioncotransporter2钾离子氯离子共转运体2（potassiumchlorideioncotransporter2，KCC2）是成年哺乳动物脑内神经元特异性表达的膜蛋白［1-2］，其对成熟神经元胞内的氯离子外排作用是维持成熟神经元胞内低氯离子浓度的重要因素，而神经元胞内低氯离子浓度的维持是抑制性神经递质γ-氨基丁酸（γ-aminobutyricacid，GABA）离子型受体发挥抑制性作用的前提［3-4］。我们以前的研究表明，成年哺乳动物脑内的缰内侧核缺少KCC2蛋白

4、的表达，同时缺少GABA的A型（GABAA）受体信号系统介导的抑制性作用［5］。正常脑功能的维持需要保持脑内兴奋性和抑制性神经元活动的稳态平衡［6］，GABAA受体介导的抑制作用是中枢神经系统内主要的抑制性信号系统。下丘脑的视上核和室旁核的神经元既具有神经元的特点，也具有分泌神经递质这一不同于神经元的特点，他们分泌的催产素和加压素对调节生殖器官活动和水电介质平衡等起到重要作用。本研究使用免疫荧光双标并结合激光共聚焦显微镜成像技术检测神经元特异性的KCC2在下丘脑视上核和室旁核中的表达。1材料和方法1.1实验动物和切片制备雄性SD大鼠，体重230～250g（徐州医学院实验动

5、物中心提供）。动物用0.4%戊巴比妥钠麻醉（60mg/kg），开胸，经升主动脉向心插管，先灌注100ml生理盐水，随后以4%冷多聚甲醛（0.1mol/L磷酸缓冲液配制，pH7.4）灌流固定，取整脑后固定6h，15%和30%蔗糖溶液各浸泡12h，30μm冰冻切片，收取含视上核和室旁核的切片置于0.01mol/L磷酸盐缓冲液中（pH7.4）。1.2免疫荧光化学反应参照文献［5］方法。主要步骤为：冰冻切片使用5%的正常羊血清室温孵育30min；第一抗体为兔抗KCC2的多克隆抗体（1∶200，Upstate）和鼠抗NeuN的单克隆抗体（1∶500，Upstate），4℃孵育48h

6、；第二抗体为驴抗鼠（FITC标记，Rockson公司，1∶200）或驴抗兔（Cy5标记，Rockson公司，1∶200）的荧光标记二抗，在二抗孵育时加入Nissl红色荧光染料（1∶400，Invitrogen），室温孵育2h；PBS洗片，贴片，无色指甲油封片，4℃保存备观察。阴性对照切片使用PBS代替一抗孵育，其他步骤同上。1.3激光共聚焦显微镜观察以阴性对照片确定染色背景，可以观察到NeuN阳性染色为绿色，KCC2阳性染色为蓝色，Nissl阳性染色为红色荧光。2结果借助Nissl染色（图1-A1、B1），可以准确确定神经元密集的视上核和室旁核在脑内的位置。在视上核内没有

7、密集的KCC2阳性信号，其阳性表达非常少（图1-B3），在室旁核内也仅观察到分布较为稀疏的阳性信号（图1-A3）。为证实神经元相关蛋白在该部位的表达缺少，使用神经元的另一标记物——神经细胞核抗原（NeuN）染色得到类似的结果，在Nissl染色细胞密集的视上核和室旁核区域仅有少数NeuN阳性表达（图1-A2、B2）。3讨论神经内分泌细胞既能接受刺激、传导神经信息，又能分泌激素。它在形态上与通常的神经元相似，有树突、轴突和尼氏体等。神经内分泌细胞产生的神经激素，由轴突末梢释放出来进入血管，通过血液循环运送到靶组织。视上核和室旁核是