室旁核注射apelin

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1、室旁核注射apelin【关键词】apelin-13室旁核胃缺血再灌注细胞凋亡c-Jun氨基末端激酶Abstract:ObjectiveToobservetheeffectsandmechanismofapelin-13microinjectionintothehypothalamicparaventricularnucleus(PVN)ongastricischemia/reperfusion(GI/R)injuryinrats.MethodsApelin-13icroinjectedintothePVNbeforetheestablishment

2、ofGI/Rmodel,pingtheceliacarteryfor30minandthefolloinetheexpressionsofcaspase-3andp-JNKofthegastricmucosalcells.ResultsparedicroinjectionintothePVNmarkedlyaggravatedthedamageingastricmucosaandenhancedtheexpressionsofcaspase-3andp-JNK.ConclusionApelin-13microinjectionintoPVNcana

3、ggravatetheharmfuleffectongastricmucosainducedbyGI/R.Keyia/reperfusion(GI/R);cellularapoptosis;JNK近年来，我们的研究工作表明，下丘脑室旁核(paraventricularnucleus,PVN)对大鼠胃黏膜缺血/再灌注(gastricischemia/reperfusion,GI/R)损伤具有调节作用，并发现其作用机制与胃黏膜细胞的增殖与凋亡的水平密切相关［1-3］。1998年，Tatemoto等［4］发现G蛋白耦联受体-血管紧张素受体AT1相关的受体

4、蛋白(putativereceptorproteinrelatedtotheangiotensinreceptorAT1,APJR)的内源性配体并命名为apelin(APJendogenousligand)。最近研究发现apelin受体广泛分布于大脑，包括视上区、下丘脑视上核和PVN，下丘脑PVN是脑内apelin能神经元胞体和apelin受体相对集中的部位［5］。下丘脑PVN对大鼠GI/R损伤的调节作用是否与apelin及其相应受体有关，这是个非常值得研究的问题。为此，我们采用核团给药手段观察PVN与GI/R损伤之间的关系，并采用免疫印迹技术，观

5、察GI/R损伤后胃黏膜细胞凋亡相关蛋白的表达情况，从而揭示PVN对GI/R损伤的调控机制。1材料和方法1.1试剂apelin-13（Sigma公司）；兔抗caspase-3多克隆抗体(Cell-signal公司)；NBT/NCIP显色试剂盒（Promega公司）；抗p-JNK小鼠单克隆抗体、β-actin鼠单克隆抗体（SantaCruz公司）；碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG、碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG、Pol/100g)手术，按文献［1-3］方法定位PVN后，在2min内将0.3μl(含apelin-130.2μg，或生理盐水)药液缓慢注入。大鼠G

6、I/R模型的制备按文献［6］方法。1.4胃黏膜损伤指数测定参照Guth等［6］方法略加改进。以腺胃区局限于胃上皮的点状糜烂、溃疡、出血灶的长度累积计分：正常为0分，损伤＜1mm计1分，＞1mm计2分，＞2mm计3分，余类推。损伤宽度超过1mm时分数加倍。每组大鼠损伤分数的平均值为损伤指数。1.5蛋白免疫印迹法(immunoblottingassay)测定caspase-3、p-JNK蛋白表达量的变化按文献［3］方法，将已制备的胞质蛋白提取液各取10μl测其蛋白浓度后，将各样品用匀浆液稀释至相同浓度，加入1/3体积的4×蛋白变性液95～100℃水浴变

7、性5min；取等量蛋白样品(50μg/lane)加入12.5%SDS-PAGE分离后，以湿转移法转至NC膜上，加入封闭液，室温封闭2h；加入一抗(抗p-JNK抗体1∶200、抗caspase-3抗体1∶1000、抗β-actin抗体1∶500)，4℃过夜，in×3次；分别加入相应的碱性磷酸酶标记的二抗(1∶500)，室温孵育2h，in×3次；加入显色剂(NBT/NCIP显色试剂盒)，反应达到要求后，流水洗涤终止反应。所得显色条带经图像处理仪进行激光扫描、定量分析及打印。对照实验以水代替一抗，其余操作相同。上述因子的蛋白激活水平分别以其免疫反应活性，

8、即免疫印迹中相应区带的光密度(D)值相对于对照组的倍数表示。1.6PVN刺激电极定位的鉴定实验完毕后，快速断头、取脑、固定