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1、双内标PCR论文【关键词】聚合酶链反应；,,酶联免疫吸附测定；,,基因定量；,,HIVEstablishmentofaquantitativePCRELISAdetectionsystemers(doprimerodifiedplifyafragmentinHIV1gagregionand2samelengthmutantfragmentsasinternalstandard,respectively.Thenodifiedplifiedthe3templatesofknoountanddifferentconcentrationsatthesameefficiencyan
2、dinthesametube.Sincetheyarked,byELISAandcalculatetheDNAcopiesofHIV1pervolumeineachsamplebyformula.RESULTS:Thereula,plificationethodisspecific,sensitiveandinloelinkedimmunosorbentassay,ELISA）法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定等特点.融合了二者优点的PCRELISA被广泛应用于临床检测领域，作为定量实验的效果很好［2］.我们以HIV1前病毒的检测为模型，通过改进，建立了PCRELISA双内
3、标（doubleinternalstandard）定量检测方法.1材料和方法1.1材料商品化的链亲和素（Avidin）预包被的96孔微孔检测板（Pierce公司，Cat.No.15500）；10×PCRbuffer，dNTPmix，MgCl2（Promega公司）；Taq酶由本室自制；AntiDIGPOD（Roche公司，Cat.No.1207733）；显色底物TMB（Sigma公司）；GeneQuantpro微量紫外分光光度计（Amersham公司）；TGRADIENTPCR仪（Biometra公司）；Elx800型酶标仪（BioTek公司）；健康人血样6例、非HIV感染
4、血样30例（甲肝、乙肝、单纯苞疹病毒、巨细胞病毒等）取自福州市第二医院；HIV感染血样4例取自福建省卫生防疫站.1.2方法1.2.1引物和探针的设计与合成设计HIV1特异性引物，上游(5′ataatccacctatcccagtaggagaaat3′)，下游(5′tttggtccttgtcttatgtccagaatgc3′)，扩增出序列为115bp的gag基因的高度保守序列［3-4］(表1)，下游引物5′端用地高辛修饰.设计竞争性高标模板(highstandard,HS)与低标模板(lo值与HIV1目的片段的参数基本一致.三种模板分别连接到pUC18载体，经EcoRI酶切线性
5、化.设计与HIV1,HS,LS序列中间互补的41base长度的单链DNA探针，分别记为探针L薄壁PCR反应管内,每管加入PCR反应混合液12μL（5μL10×PCRbuffer，1μL10mmol/L的dNTP，6μL25mmol/L的MgCl2，各1μL的上、下游引物）,按不同实验要求加入所需的各种模板，Taq酶5U（本室自制），加ddH2O,使终体积为50μL.经本室优化后的PCR扩增参数如下:95℃,5min后;94℃,30s;56℃,1min共33个循环（由本室前期实验确定其未达到平台期），再72℃延伸3min.1.2.4微孔板酶联杂交定量以HIV1的起始拷贝数做一
6、梯度实验，即分5个实验组，每PCR管中HIV1拷贝数分别为500，1000，2000，5000，7000，每组做3个平行的PCR管，每管中HS为10000拷贝，LS为50拷贝.每PCR管各取10μL到3个变性试管，于95℃10min解链，马上置于0℃冰盒上猝冷.各加入200μL含110pmol的探针in/次，弃液，拍干.加AntiDIGPOD后温育30min，每孔用300μL的洗涤液洗涤，重复5次，加入显色液，10min后用50μL的2mol/LH2SO4终止反应［5］.酶标仪测A450nm值，参照波长为630nm.1.2.5野生型模板初始量的确定方法依据三种模板起始拷贝数
7、与其对应探针最终检测的A值成正比推导出公式：计算出的拷贝数Y=10X,X=lg(L0)+(lg(H0)-lg(L0))×(远大于检测产物的量，因此是符合实验条件的.是否设置内参以及恰当的设置是衡量PCRELISA定量效果的一个重要标准.由于本实验设有两个内参，因此批间差异有可能在内参标准的校正下不影响实验结果.无内标的PCRELISA只能对目的DNA做定性分析，定量则需在实验中加入内标.以往国内定量PCRELISA的研究中通常使用单内标方法，但其结果是不同浓度组之间的批间和批内差异都比较大，平均误差在36％左右［9
